protocol：小鼠胚胎干细胞培养实验方法和操作步骤-2

体外向心肌细胞方向分化

胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。

培养基：
EB 配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。

贮存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）
PEST（P104U/mlS104μg /ml
ITSFn and N3（分化培养基）

配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。

贮存液
DMEM(高糖)
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM
黄体酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
层粘连蛋白100μg/ml
纤维连接蛋白250μg/ml
碱性rhFGF, 10μg/ml

*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。

ITSFn and N3培养基贮存液的准备

使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。

贮存液 溶剂，贮存液，稀释剂和储存
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM
黄体酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
层粘连蛋白（100μg/ml）
纤维连接蛋白（250μg/ml ）
碱性rhFGF, （10μg/ml）

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

包被液的准备
多聚-L-赖氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被过程：
1、加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）
2、吸出多聚-L-赖氨酸
3、加入纤维结合蛋白，大约1－2小时
4、吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干
5、贮存在4℃

24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。