常用DAN探针制备的方法介绍--PCR 标记

PCR 技术是1985年 KarryMullis 等首先创建的可在体外迅速、大量地扩增一定长度的核苷酸序列的技术。PCR问世以来已广泛应用于分子生物学研究和疾病诊断中。此技术还应用于核酸探针的制备。Girgsi 等(1988)应用 PCR 从多序列制备了 DNA 探针。Shcow-aletr 和 Sommer 应用 PCR 制备了放射性标记 DNA 和 RNA 探针。PCR 标记(polymerase chain reaction labeling)方法是:组分为模板 DNA(100pg/μL),15μL dCTP(5mmol/L,32P标记),引物混合物(每一种15碱基寡核苷酸引物浓度为20mol/L 的水溶液),1×20倍浓缩无dCTP的反应混合物(1mol/L KCl,0.2mol/L Tris-HCl,30mmol/L MgCl2,0.2%明胶,分别为4mmol/L 的 dATP、dGTP、dTTP),1μL 水和20μL 矿物油。1单位Tag,DMA 聚合酶扩增94℃ 5min,50℃退火2min、72℃延伸3min、94℃变性 1min 的 PCR 流程进行30个循环,后延伸10min。这样dCT 32P在PCR 循环过程中就掺入扩增的 DNA 链中,经分离制备出放射性标记探针。PCR 标记具有以下优点:

(1)标记物特异,活性稳定。

(2)易于控制特异活性和标记物的数量。

(3)可高效率的标记少于500bp 的片段。

(4)可高效率地掺入到大范围的模板 DNA 中。

(5)可直接标记基因组 DNA。