酶法合成油酸丙二醇单酯
丙二醇脂肪酸单酯是一种优良的非离子型乳化剂，可以形成稳定的油包水体系（HLB值约为3.5），在食品和医药保健品中有广泛的应用。丙二醇脂肪酸单酯以α-晶型形式存在，没有多晶性，能使其他乳化剂的α-晶型稳定，还可以作为晶型调节剂应用于人造奶油和起酥油中[1]。已有研究表明，丙二醇脂肪酸单酯通过结合到高熔点脂肪晶体的晶格中从而起到调节晶型的作用。丙二醇脂肪酸单酯与甘油三酯的β晶型共结，从而阻止固态晶体向高熔点的β晶型转变，丙二醇单酯不但能很好地起到抑制β晶型的甘油三酯向β晶型转化的作用，而且本身没有不良的色泽和色味，成为乳化剂中较优的选择[2]。
目前市场上流通的丙二醇单酯产品多为硬脂酸、棕榈酸丙二醇单酯，长链饱和脂肪酸的丙二醇单酯是良好的固体脂肪晶型调节剂；但其熔点较高，难以作为液态油脂的乳化剂，在液态酥油等产品中应用效果较差。不饱和脂肪酸型的丙二醇单酯熔点低，而且保留了良好的乳化性能。由于不饱和脂肪酸的稳定性较差，物理和化学工艺难以合成品质良好的不饱和脂肪酸丙二醇单酯产品。而脂肪酶催化的生物合成工艺，具有活性高、专一性好以及反应条件温和等优点，广泛应用于食品加工、医药制品的生物法制备。李伟等[3]，在无溶剂体系中，以固定化脂肪酶Novozym 435催化1，2-丙二醇月桂酸合成1（2）-丙二醇月桂酸单酯，酯化率可以达到91.89%，1（2）-丙二醇月桂酸单酯纯度达到79.22%。钟遇安等[4]以叔丁醇为溶剂，利用脂肪酶催化橄榄油与1，2-丙二醇进行酯交换反应制备丙二醇单脂肪酸酯，产物中1（2）-丙二醇脂肪酸单酯的含量可以达到72.4%。汪运明等[5]，在无溶剂体系中，利用脂肪酶催化椰子油与1，2-丙二醇进行醇解反应，制备合成椰子油基丙二醇单酯，丙二醇单酯的生成量达到53.48%。
本研究，利用常用的商品化脂肪酶催化制备亚油酸型的丙二醇单酯，比较了不同脂肪酶对底物的专一性，并对酶法制备工艺进行了考察，为开发不饱和脂肪酸丙二醇单酯的酶法制备工艺提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料和设备
1.1.1 材料和试剂
脂肪酶Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM均购自丹麦诺维信（中国）生物技术有限公司。1，2-丙二醇，分析纯，上海凌峰试剂有限公司；油酸（纯度97%），阿拉丁试剂公司；等摩尔脂肪酸混合物为实验室自制。
1.1.2 仪器和设备
DF-101S集热式恒温磁力搅拌器；ANKeTDL-40B台式离心机；富斯特FX-8型旋片真空泵；Waters 2695 型高效液相色谱议，配备Waters 2414型示差检测器（美国Waters公司）；MD-S80型分子蒸馏，广州汉维冷气机电有限公司。
1.2 酶法制备丙二醇脂肪酸单酯
脂肪酶催化亚油酸与丙二醇酯化制备丙二醇单酯，在50mL具塞三角瓶中按一定的底物摩尔比称量一定量的油酸和1，2-丙二醇，底物混合物的质量为17.8g；将三角瓶置于恒温加热磁力搅拌器中预热到一定温度，添加一定量的脂肪酶开始反应，需要真空条件下反应时连接真空泵，并每隔一定时间取样，分析反应混合物中的组成。
1.3 酯化产物HPLC分析
取1mL反应混合物，在10000 r/min下离心5min，取上层油相0.02mL于2mL EP管中，加入0.5g的无水硫酸钠，1mL的流动相（正己烷：异丙醇：甲酸=18：1：0.003），膜过滤后进行高效液相色谱分析。
液相色谱为配备Waters 1525视差检测器的waters2695系统；色谱柱为Phenomenex Luna Silica （2） （4.6 mm i.d. × 250 mm， 5μm particle size），色谱柱温为30C，流动相流速1.0 mL/min。（物质的出峰顺序为：1，2-丙二醇二酯、油酸、1-丙二醇单酯、2-丙二醇单酯，不同组分利用标准品进行定性，各个组分含量按面积归一化法进行计算。
1.4 脂肪酶对脂肪酸专一性考察
在25ml具塞三角瓶中加入1.7g等摩尔脂肪酸、0.79g1，2-丙二醇、和50mg固定化酶，50℃反应10min，10000rpm离心3min后，将油相全部转移至分液漏斗中，加入4mL 30% KOH-乙醇溶液，充分混匀混匀后加入10mL正己烷萃取，回收正己烷相，挥发除去正己烷后进行甲酯化处理，用气相色谱分析甲酯的脂肪酸组成；气相色谱方法，采用文献[6]中的分析方法。
脂肪酶催化脂肪酸与丙二醇酯化反应中，竞争因子（α）的倒数（1/α）称为底物专一性常数（kcat/Km），用于评价脂肪酶的脂肪酸的特异性。由 Rangheard 等[7，8]提出的反应底物的竞争因子应用于描述脂肪酶的脂肪酸的特异性。
1.5 酯化率计算
2 结果与讨论
随着生物化工技术的发展和酶制剂生产技术的提高，脂肪酶的生产工艺越来越成熟，从而使得脂肪酶的生产成本逐渐降低，脂肪酶可以更加广泛地应用于食品和化工领域。脂肪酶催化合成医药和食品中常用乳化剂是一个长期研究的课题，部分研究成果已经实现了产业化应用。本研究，利用商品化脂肪酶开发不饱和脂肪酸丙二醇单酯生产技术，为酶法制备丙二醇单酯技术的应用和推广提供科学依据和技术支持。
2.1 脂肪酶对酯化反应制备丙二醇单酯的影响
脂肪酶是一种具有良好的底物特异性的生物催化剂，包括其对甘油酯底物的专一性（如一酯、二酯、三酯等）、酰基/羟基位置专一性等。本研究考察不同脂肪酶催化脂肪酸与1，2-丙二醇进行酯化反应时，催化剂对丙二醇羟基位置专一性对酯化反应制备丙二醇单酯的影响，结果如图1和图2所示。
由图1可以看出，在本反应体系中Lipozyme TL IM不能催化油酸和丙二醇进行酯化反应，这可能是由于其载体为极性材料硅胶，而硅胶很容易被丙二醇包裹，极大地降低了传质效果；Lipozyme RM IM和Novozym 435均可以催化油酸和丙二醇进行酯化反应，反应6h后酯化率基本达到平衡；与Novozym 435相比，Lipozyme RM IM具有更高的催化效率。
由图2可以看出，酯化产物以丙二醇单酯为主，而且在酯化反应达到平衡时，以Lipozyme RM IM为催化剂的反应体系中，丙二醇单酯的含量更高；以Novozym 435为催化剂的反应体系中，酯化反应在1h后丙二醇单酯的含量达到最高，继续反应时丙二醇单酯的含量逐渐降低，这是由于Novozym 435对丙二醇Sn-1和Sn-2位羟基的位置专一性较弱，可以催化1（2）-单酯与油酸继续酯化成为丙二醇二酯。液相色谱分析显示，Lipozyme RM IM催化酯化反应产生的单酯以1-丙二醇单酯为主，这说明Lipozyme RM IM对于1，2-丙二醇的sn-1位羟基具有较强的位置专一性，适用于酶法合成丙二醇单酯。
2.2 脂肪酶对脂肪酸专一性的影响
脂肪酸是脂肪酶的天然底物，不同的脂肪酶对脂肪酸专一性也有很大差别，脂肪酸的碳链长度、双键数目及双键的位置均对脂肪酶的催化活性有显著影响。例如，来源于南极假丝酵母的脂肪酶Lipase CALB和来源于玫瑰假丝酵母的脂肪酶Lipase AY30，对于共轭亚油酸（CLA）中的双键位置具有相反的专一性，因而被用于CLA异构体的酶法拆分。本研究考察了脂肪酶Lipozyme RM IM、Novozym 435在催化脂肪酸与丙二醇酯化时对常见脂肪酸的专一性，结果如图3所示。
由图3可以看出，在本反应体系中，与常见的不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸、亚麻酸）相比，Novozym 435对饱和脂肪酸的催化活力更高。而Lipozyme RM IM在催化脂肪酸与1，2-丙二醇进行酯化反应时，对不饱和脂肪酸的催化活力更高，对油酸的专一性最强，因此可以选择Lipozyme RM IM进行酶法合成油酸丙二醇单酯酶法合成工艺的研究。
2.3 反应温度对酯化反应合成丙二醇单酯的影响
反应温度是影响酶促反应的重要因素，在酯化反应体系中，温度不仅可以影响脂肪酶的催化活力，也会对丙二醇单酯中脂肪酸酰基转移的速率产生影响。本研究考察了以Lipozyme RM IM为催化剂，酯化合成1，2-丙二醇单酯时温度对酯化率和丙二醇含量的影响，结果如图4和图5所示。
由图4可以看出，反应温度对酯化率有显著影响，在45°C到55°C之间时，随着温度的上升，酯化反应速率迅速增加。当酯化反应温度达到60°C后，反应速率下降，并且1h后酯化率上升不显著，这可能是由于温度过高，使得脂肪酶失去了催化活力。由图5可以看出，在45°C到55°C之间，随着温度的升高，丙二醇单酯的含量也显著增加，其中反应温度为55°C时，酯化反应体系中丙二醇单酯的含量最高，可以达到51%以上。
2.4 丙二醇单酯的分离纯化
酯化反应产物中含有未反应的脂肪酸、1，2-丙二醇，要得到丙二醇单酯的产品，需要对酯化反应产物进行分离纯化。目前，分离纯化丙二醇单酯的方法有分子蒸馏、溶剂萃取以及碱中和法。其中，分子蒸馏工艺分离回收丙二醇单酯得率高，而且无溶剂残留等问题。
本研究将酯化反应混合物离心回收上层油相得到脂肪酸与丙二醇酯的混合物，下层的固定化酶和未反应的丙二醇可以回收再次利用。上层油相通过分子蒸馏分离回收丙二醇单酯，在进料速度为36ml/min，蒸馏压力4.1Pa时对分子蒸馏温度对产物中丙二醇单酯的含量及其得率的影响进行了考察，结果如图6所示。
蒸馏温度是影响分子蒸馏分离纯化丙二醇单酯的关键参数，由图6可以看出，在温度由100℃升高至140℃过程中，产物中丙二醇单酯的含量逐渐升高，在140℃时达到94.7%，而且此时丙二醇单酯的得率可以达到97.6%，这说明在此蒸馏条件下，脂肪酸和丙二醇单酯实现了良好的分离；继续升高蒸馏温度至150℃时，丙二醇单酯的含量增加不显著，但是其得率显著降低（90.1%），这可能是由于蒸馏温度过高，丙二醇单酯也随着轻组分一起被蒸馏出来，使得重相组分中的丙二醇单酯的含量降低。
3 结语
本研究考察了不同商品化的固定化脂肪酶催化油酸与1，2-丙二醇酯化制备丙二醇单酯的效果，发现Lipozyme RM IM对油酸的选择性最高，而且适用于无溶剂体系中制备油酸丙二醇单酯。通过对酶反应温度的考察确定了在酶反应温度为55°C时，酯化率最高，而且酰基转移效率较低，丙二醇单酯的得率最高；利用分子蒸馏分离纯化酯化反应产物中的丙二醇单酯，得到含量为94.7%的丙二醇单酯产品，其得率可以达到97.8%。
