乙肝筛查需重视HBsAg突变体检测
乙肝表面抗原（HBsAg）是临床上应用最多的HBV感染血清标志物，它是WHO公认的判断HBV感染的关键指标【1】。HBV复制周期快且聚合酶易错配，导致HBV复制过程中突变率非常高。在内源性（宿主免疫清除）和外源性（疫苗、HBIG和抗病毒治疗）选择压力下非常容易选择出新的逃逸突变株。HBsAg突变会造成检测试剂的漏检，这对于输血和手术安全构成重大隐患，也会对疾病进展和疗效判断造成重要影响。因此，研究如何提高对HBsAg突变体的检出能力，具有重要意义。
HBsAg的突变及其后果
HBV的基因组包含4个开放读码框（ORF），分别为S、C、P和X。这4个读码框分别编码病毒的包膜S蛋白(HBsAg)、核心C蛋白(HBcAg)和HBeAg、聚合酶及X蛋白。S-ORF全长1167nt，由Pre-S1、Pre-S2和S基因组成，分别编码前S1蛋白、前S2蛋白和HBsAg，前两者与HBV感染肝细胞有关，HBsAg是引起机体产生保护性免疫的主要成分。HBsAg由5个跨膜区及3个膜外区构成，HBsAg暴露在表面由99-169位氨基酸（aa）组成的区域，称为主要亲水区（MHR），具有免疫原性。HBsAg的免疫优势区域“a”决定簇就位于MHR中，在所有基因型中均存在。针对“a”决定簇的抗体可对HBV所有基因亚型提供保护性免疫，“a”决定簇也是检测HBsAg 的主要靶点【2】。
HBsAg的突变，主要四种类型：
（1）自发性突变：HBV的生活周期存在逆转录过程，而且DNA多聚酶不具备自我纠错（self-proof）功能，因此存在较高的自发性突变率【3】，HBV的突变率是一般DNA病毒的10倍。慢性乙型肝炎患者体内HBV自然变异率约为1.4-3.2*10^5/位点/年【4】。此外，突变有一定的倾向性，主要发生在BCP区，前C区、P区和S区的“a”决定簇【5】。
（2）人群选择：根据HBV基因组序列差异性≥8%，可以将HBV划分为9个基因型，分别命名为A-I。依据S基因序列差异性≥4%，又可将HBV基因型划分为20个亚型：A1-A3，B1-B4，C1-C4，D1-D4，E，F1，F2，G，H和I【6】。根据HBsAg第122位和160位氨基酸的差异可以将HBsAg分为adr，adw，ayr，ayw共4个血清型。不同的HBV基因型是病毒变异后的稳定形式，是多年人群选择压力的结果。
（3）免疫逃逸：疫苗和免疫球蛋白治疗导致的逃逸突变主要源自于免疫压力。免疫逃逸的结果导致出现了疫苗逃逸突变株、诊断逃逸突变株。中国实行普遍的乙肝疫苗接种计划，更使得乙肝疫苗逃逸突变大大增多。大型乙肝疫苗接种程序数据显示，HBsAg突变导致了2%-3%的疫苗逃逸突变，特别是145位点甘氨酸置换为精氨酸（G145R），此位点突变使抗原不能结合到野生型抗-HBs【7】。
（4）耐药突变：核苷类似物用于治疗慢性乙型肝炎患者导致聚合酶突变，由于S基因和P基因的RT区具有部分重叠，RT区的基因变异也可以导致HBsAg出现氨基酸的改变。随着核苷类似物在临床上的广泛使用，这种可能性日益增加【8】。
HBsAg的突变会引发以下临床事件：（1）疫苗保护失败，HBsAg主要抗原决定簇重要氨基酸的改变会导致预防接种失败。（2）诊断试剂漏检，由于氨基酸的改变影响了抗原抗体的结合能力而造成实验室诊断的假阴性结果。（3）抗病毒治疗失败，由于HBsAg与聚合酶重叠，HBsAg突变可能会改变聚合酶，从而导致核苷类似物治疗的失败。（4）HBsAg阴性的隐匿性乙型肝炎，这些感染者如果作为献血员和肝移植供体将会通过输血和肝移植传播HBV。（5）加速HBsAg阴性乙型肝炎患者向肝硬化进展，同时容易引发免疫抑制后HBV再活动甚至是暴发性肝衰竭。（6）抗病毒治疗期间假HBsAg血清学转换或血清学清除，即由于S基因突变，而表现为HBsAg血清学转阴【8】。
HBsAg突变体检测是乙肝筛查的重点
HBsAg突变所造成的漏检，对于献血安全、疾病进展和疗效判断都有很大影响，因此提高HBsAg突变检出率十分必要。Huang等报道【9】，在中国人群中HBsAg主要亲水区（MHR）发生突变的概率很高，在隐匿性乙肝感染者中达到55.7%，在HBsAg携带者（血清HBsAg ≤100IU/ml）中达到34.0%，在HBsAg携带者（血清HBsAg＞100IU/ml）中达到17.1%。如此高的HBsAg突变率，使得当前的HBsAg试剂检测能力下降，这对检测试剂对于HBsAg突变体的灵敏度提出了更高要求。
目前用于HBsAg筛查的免疫学方法主要有金标法、酶免法（ELISA）、化学发光法（CLIA）等，其中化学发光法具有很高的灵敏度和特异性，逐渐替代金标和酶免法，成为主流。但是市场上的发光试剂品牌种类繁多，对HBsAg突变体的检测能力差距很大，如何选择理想的试剂，避免漏检，成为检验科面临的重要课题。
Natale等报道【10】，使用意大利索灵LIAISON XL系统与厂家A系统，对包含10种HBsAg常见突变体的血清盘进行了评价，结果表明，索灵试剂能将这10种突变体全部检出，而厂家A试剂有两种漏检（表1）:
表1：HBsAg常见突变体血清盘的评价
Dorizzi等报道【11】，用同样的这个包含10种HBsAg常见突变体的血清盘，评估索灵和其他几个进口厂家的HBsAg试剂的突变体检测能力，发现与以上报道类似的结果，索灵可以全部检出这10种突变体，优于其他厂家。
Ly等报道【12】，使用包含54种重组HBsAg突变株和71种天然HBsAg突变株的血清盘对几种主流进口化学发光法HBsAg商业检测试剂进行评估，发现索灵在总计125种HBsAg突变体中检测出111种，表现出最优的突变体检测能力（表2）：
表2：HBsAg突变体检测评估比对
总之，目前HBsAg突变在中国人群中十分普遍，如果筛查和诊断试剂对突变体的灵敏度不够，会造成漏检的严重后果，威胁输血、手术和其它医疗操作的安全，也会给医患关系带来麻烦。因此，使用性能优秀的试剂，提高检验科对HBsAg突变的的检出能力，具有重要意义。
参考文献
【1】Seeger C, Mason WS. Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev, 2000, 64 (1): 51-68.
【2】HBsAg基因变异及其意义；张振华，邓万玉，陆蒙吉，杨东亮；临床肝胆病杂志第29卷第11期2013年11月
【3】GUNTHER S, FISCHER L, PULT I, et al. Naturally occurring variants of hepatitis B virus. Adv Virus Res, 1999, 52: 25-137.
【4】HBV S区基因变异与HBsAg检测；高春芳；中华检验医学杂志2010年6月33卷第6期
【5】OKAMOTO H, IMAI M, KAMETANI, et al. Genomic heterogeneity of
hepatitis B virus in a 54 year old woman who contracted the infection through materno fetal transmission. Jpn J Exp Med, 1987, 57(4): 231-236.
【6】NORDER H, COUROUCE AM, COURSAGET P, et al. Genetic diversity of hepatitis B virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotyped,and HBsAg subtypes, Intervirology, 2004, 47(6):289-309
【7】Hunt CM，McGill JM，Allen MI，et a1．Clinical relevance of
hepatitis B viral mutations．Hepatology, 2000, 31: 1037-1044．
【8】HBsAg突变的挑战及其应对；张欣欣；中华检验医学杂志2013年3月第36卷第3期
【9】Influence of mutations in hepatitis B virus surface protein on viral antigenicity and phenotype in occult HBV strains from blood donors, Cheng-Hao Huang, Ning-Shao Xia et al. Journal of Hepatology 2012 vol. 57, 720–729.
【10】ASSESSMENT OF THE LIAISON® XL MUREX ANALYZER FOR THE DETERMINATION OF HBsAg, ANTI-HCV AND HIV MARKERS, XL Congresso Nazionale AMCLI 8-11 novembre 2011, C. Di Natale; P. Fonio; E. De Vitis; G. Fortina,Microbiology Laboratory, “Maggiore della Carità”University Hospital, Novara, Italy.
【11】COMPARISON OF LIAISON® XL MUREX AUTOMATED IMMUNOASSAYS TO ADVIA CENTAUR FOR THE DETECTION OF HBsAg, ANTI-HCV AND HIV MARKERS,2012 AACC Annual meeting - Poster E-107, R.M.Dorizzi, P.Billi,M.Della Strada, S.Semprini, S.Pelliconi, F.Benini - Laboratorio Unico AVR,Cesena, Italy.
【12】Sensitivity of five new Hepatitis B surface antigen assays, Thoai Duong Ly, Mélanie, Poster 22nd Regional Congress of the ISBT, AsiaTaipei, November 19 - 23, 2011.
