测量生物发光共振能量转移
fff简介分子之间的能量转移大多是由辐射导致的。然而当不同荧光物质非常靠近时（<10nm），会发生共振能量转移（RET）。荧光共振能量转移（FRET）是一种的型的 RET现象。
图1 所示在 FRET 中，使用强光照射以激发供体能量，处于激发态的供体将一部分或全部能量转移给
受体，受体被激发。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果受体也是一种荧光发射
体，则呈现出受体的荧光。光照下很多荧光物质会逐渐失去其荧光特性，这种现象被称为光漂白。为了提高灵敏度，近期生物发光共振能量转移（BRET）得到了广泛应用1。BRET使用生物发光物质代替了荧光供体。由于BRET不在需要直射光线以激发供体，不存在放射性的能量转移，所以避免了对样品的损害（如图2）。荧光素酶是一种萤火虫体内的生物发光酶，被广泛用于 BRET研究2。本实验中，选择Luc8（海肾荧光
素酶）作为供体（图3），该物质由海肾（Renillareinformis）基因突变而来。如图4所示，Luc8 的生物
荧光峰值接近480nm。
图2：BRET示意图
图 3：海肾（左）和Luc8蛋白结构（右）
图 4：Luc8的发射光谱右）
本实验中，使用了四种类型的量子点（605、655、705和800）：它们具有高量子产率，并适用于多种荧光波长（图5）。这些量子点在较大的波长范围内都有吸收，但是在605、655、705和800nm时发出的荧光较强。
图 5：量子点的结构（左）和荧光（右）
发光强度相对于强光直射产生的荧光强度较弱，同时使用微量比色皿获得的光量较小。为了在测量 BRET时能够更加地收集光，本实验使用了发光微量池支架，该配件可zui大程度减少微量池与发射透镜之间的距离（图6）。
试剂和仪器
1.Lumina荧光分光光度计
2.发光微量池支架
3.PBS缓冲液0.1M（pH 7.4）
4.Luc8 150 M
5.量子点605、655、705、800 8 M（Invitrogen）
6.腔肠素H 1 g/ l 甲醇溶液（Promega）
7.NiCl2 100 M 蒸馏水溶液（Sigma Aldrich）
8.10 l 微量离心管
9.45 l 荧光微量池
10.吸液管和吸液头
11.涡旋混合器
实验步骤
1.准备4个10 l 微量离心管。
2.在每个离心管内填充94 l PBS 缓冲液和 1 l Luc8（供体）。
3.在每个离心管中添加5 l量子点605、655、705、800（受体）。
4.在每个离心管中注入2 l NiCl2溶液（供体和受体之间的结合试剂），并在充分混合。
5.将发光微量池支架安装到Lumina上，注入样品并插到支架上。
6.打开Luminous WaveScan 软件，输入设定参数，点51击应用（Apply）（图7）。
7.使用吸液管注入2 l腔肠素H，迅速合拢测试舱盖，点击开始按钮。
8.应用基线校正功能对测得的光谱进行校正。单击基线校正（Baseline Correction）图标，使用具有zui低生物发光强度的波长进行基线校正（图8）。
9.根据Luc8峰值对光谱进行标准化校正，比较量子点峰值。为了标准化，计算各个转换标量，使得所有Luc8峰值强度相等。然后单击标量计算器（Scalar Calculator）图标，通过乘以转换标量对其进行标准化转换（图9）。
仪器参数
图 7：波长扫描测量条件
图 8：基线校正窗口
实验结果
从测得的光谱上，可以观察到BRET现象，Luc8与各量子点发生了生物发光能量转移（图10）。由于多重量子点结合可在单个波长条件下产生多种波长，因此使用量子点的BRET对分子诊断和成像领域均有很大助。BRET 能量转移的效率的因素有：（1）供体和受体之间的间隔距离；（2）供体发射和受体激发光谱的重叠。通过比较使用Luc8峰值进行标准化校正的光谱，我们可以证实量子点665-Luc8结合物在多个结合物中产生的BRET效率zui高。
实验结论
Thermo Fisher公司的Lumina荧光分光光度计和发光微量池架配件有助于检查BRET，其产生的噪音要小于FRET。此外，实验证明根据量子点发射波长的不同，BRET现象可应用于较广的波长范围。
