基因编辑进展梳理 Part II 基于CRISPR-Cas9的技术应用篇(四)
6. 基于CRISPRi的高通量技术快速绘制人类基因的功能图谱
2018年7月，Cell刊登了美国加州大学旧金山分校的研究小组的研究成果，开发了一种基于CRISPR的高通量技术快速地绘制人细胞中将近500个基因的功能图谱，其中的许多基因之前从未被详细地研究过。人类目前研究过的基因还不到10％，剩余的基因功能我们还一无所知。传统测试基因功能所需的方法既昂贵又耗时。开发一种快速而又全面地确定这些未经研究的基因功能将有助于科学家对生物学的更广泛理解。该研究使用了一种被称作基因相互作用图谱（genetic
interaction
mapping）的技术，用于建立对人体中基因功能的全面解析。利用一种被称作CRISPR抑制（CRISPRi）的工具，能够在不编辑DNA本身的情况下降低基因活性，系统性地关闭单个细胞中的成对基因并测量细胞如何作出反应，阐释这两个基因之间的关系，能够快速地归类未知功能的基因。利用这一系统，研究人员鉴定出了参与细胞能量产生的新基因，并解释了为何一些胆固醇药物可用于治疗骨质疏松症而相关药物没有这种效果的长期谜团。该研究最终的目的将计划绘制整个人类基因组中的全基因功能框架[6]。
7. EvolvR：一种结合CRISPR和DNA聚合酶来促进细胞内特定基因进化的平台
2018年8月，加州大学伯克利分校创新基因组学研究所在Nature上发文，提出了一种可以利用自然进化力量的变革性新方法---一个促进细胞内特定基因进化的平台。他们将这个新系统命名为“EvolvR”，这一系统是将Cas9同一种DNA聚合酶融合，利用一种nicking-Cas9只切割两条DNA链中的一条，形成的特殊切口会通过聚合酶补齐。DNA聚合酶补齐的过程会产生错误，导致出现各种不同类型的突变。因此聚合酶这种错误能带来更多的基因多样性，利用EvolvR人为地制造随机突变，创造数百万种不同的序列组合，从中发现许多人为需要的突变物种。这一系统甚至可以实现在一次实验中得到数千种不同的基因多样化，创造出全新的功能，而不仅仅是打开和关闭基因[7]。
8. Pro – Codes：利用蛋白质条形码技术高分辨率分析数百种基因功能的系统
2018年10月，上来自西奈山医院的研究人员在Cell期刊发文，开发了一种在蛋白质水平上的条形码系统( Pro -
Codes)，使用线性表位的组合来创建更高倍数的蛋白质条形码，可以同时分析数百种基因功能，分辨率可达单细胞水平。利用合成蛋白“抗原决定簇（epitopes）”标记和追踪不同的CRISPRs，Pro-codes能同时兼容数百个CRISPRs以敲除大量基因，并通过质谱流式细胞技术进行分析。目前利用DNA作为条形码的基因筛选技术仅能实现有限的表型和粗略的细胞分辨率。新型Pro-Codes技术能够以单细胞分辨率同时对100个基因进行高维蛋白质水平的表型分析，可以更全面地描述单个基因的生物学效应[8]。
9. 通过CRISPR-Cas9靶向剪切位点来全基因组筛选功能性LncRNA新策略
2018年11月，为弥补之前建立的基因组大片段删除、CRISPRi和CRISPRa等方法进行lncRNA的高通量功能性筛选在效率、质量（假阳性、假阴性）上的不足，北大魏文胜课题组在Nature Biotechnology杂志发文提出了一种新的筛选策略，通过构建特异性靶向基因的剪接位点的新型CRISPR文库，以高通量的方式产生基因的外显子缺失或者内含子滞留。运用这一策略，实现了全基因组水平上对lncRNA功能的高效筛选，筛选并发现了230个lncRNA与细胞存活或增殖相关。并通过进一步分析表明，lncRNA功能在不同细胞种类中具有显著异质性。这一新型高通量技术平台的建立，首次真正实现了从全基因组水平对长链非编码RNA进行基于完全敲除的高通量筛选，该方法学将为系统发现和解析lncRNA功能提供有效工具[9]。
10. SLICE：一种利用Cas9蛋白电穿孔进行单向导RNA慢病毒感染的系统
2018年11月，来自美国加州大学旧金山分校的研究人员在Cell期刊发文，提出一种基于CRISPR的筛选工具-SLICE，一种利用Cas9蛋白电穿孔进行单向导RNA慢病毒感染的系统。基于sgRNA慢病毒文库的传统CRISPR筛选技术因慢病毒载体编码Cas9蛋白时间太长对于体外培养时间有限的原代T细胞来说受到限制，而SLICE系统将通过将sgRNA慢病毒文库与Cas9蛋白电穿孔相结合的方式，能够快速导入患者的原代T细胞中并评估各个基因的功能。这种新方法能够为免疫细胞抗癌的改造以及其他疾病的指导提供强有力的依据[10]。
