分子量几百的选多大孔径色谱柱
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从上一文中，我们知道，要保证分子稳定的保留行为，首要的一点是需要保证样品分子能自由进出小孔。而自由进出的前提是孔径大于样品分子直径的四倍以上。那么，分子大小与分子有什么关系呢？
对于较小的分子（<1kDa）来说，常规80~120 Å的小分子分析柱已可以满足待测物自由进出小孔的要求。对于更大的分子，则需要更大孔径（300Å）的填料。但是，随着孔径的增加，能使待测物产生有效保留的表面积却会成比例的下降。如下图所示：
孔径对表面积的影响
a ：近似值，随孔体积而改变，与填料制备工艺有关。
因此，最理想的孔径应该是能让待测物自由进入到孔内，却不会过度地降低表面积和柱容量。
另一方面，若孔径太小，导致待测物无法进入孔内而被排阻在填料颗粒外，只能与颗粒的外表面（小于孔总面积与柱容量的1%）相互作用。
溶质和孔径对保留值的影响如下图所示：
（流动相：pH2.3磷酸盐缓冲液：乙腈=65:35）
作为小分子肽类的血管紧张素I和II（分子量约为1000Da），在孔径为10nm时，保留值达到最大。当孔径小于10nm时，两种肽类均被排阻而使保留值降低；当孔径大于10nm时，色谱柱表面积下降因而伴随着柱容量和保留值的降低。
而对于大分子蛋白质>10000Da，由于在小孔径颗粒填料中都被得到了排阻，仅在填料孔径达到30nm时才能有效渗入而有效保留。如下图所示：
（流动相：pH2.3磷酸盐缓冲液：乙腈=51:49）
孔径大于30nm的色谱柱能有效地用于分离分子量小于或灯会50kDa的蛋白质分子，而孔径为100~400nm的色谱柱则更适用于大球型或/和变性的蛋白质。这里需要特别说明一下，当孔径大于或等于100nm时，颗粒的表面积会大幅下降并通常表现出较差的机械强度。
需要谨记的是，当蛋白质变性后，其流体动力学的直径会增加2~3倍。因此，如果想要在变性条件下分离蛋白质，那么就必须选用大孔径的色谱柱（在体积排阻法里特别重要）。
尽管多肽并不会像上述蛋白质那样分子量大，但是在分离较大的肽类时，仍需注意孔径的选择。上述孔径的选择性对一些大分子非肽类也同样适用，尽管肽类和常规有机大分子在反相色谱的保留行为上有较大差异。
相较于其他参数，由于市售商业柱孔径差异并不大，针对这个参数的柱筛选也较为简单。当然，对于多肽的分析，往往并不像小分子待测物，基本上仅需单独的反相或/和简单的正相即能解析杂质谱。多肽往往需要增加离子色谱、体积排阻色谱来互补研究其杂质谱。体积排阻色谱是通过待测物分子大小来分离的，故其对孔径的要求就显得非常重要。当然，通常此类色谱柱往往给出的是可分离待测物的分子量范围：
