荧光原位杂交（FISH）和用引物介导的原位标记（PRINS）操作规程

设备

    1、 医用微波炉；

     2、 水浴锅；

     3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；

     4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。

FISH试剂

    （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；

     （2）20×SSC（pH7.0）；

     （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；

     （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。

     （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。

     （6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。

实验步骤

     1、脱蜡：

     1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；

     2）100％酒精两次，每次2min；

     3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

     2、蛋白酶处理:

     1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

     2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。

     3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

     4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

     3、变性：

     1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；

     2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；

     3）78℃孵育8min；

     4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；

     5）空气干燥。

     4、杂交：

     1）准备探针；

     2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

     3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；

     4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

     杂交后的水洗：

     5）镊子小心去除盖玻片；

     6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；

     7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；

     8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

     检测：

     9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

     10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；

     11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。

扩增：

     12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

     13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

     14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；

     15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

     16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

     17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。

    5、细胞核染色：

     1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；

     2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

PRINS步骤

    1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；

    2、用0.2mol/L盐酸处理5min；

    3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；

    4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；

    5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；

    6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；

    7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；

    8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；

    9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；

    10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；

    11、BufferⅢ液洗5min；

    12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；

    13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。