盘绕螺旋结构的设计和优化技巧实验（五）

3.2.4.1 螺旋长度

一般来说，在盘绕螺旋链长度增加时，观察到稳定性的（线性）增加 [61] 。这是因为盘绕螺旋的序列将会起到额外的重要作用。例如，Lau 和 Hodges 构建了一个比原肌球蛋白（ 284 残基盘绕螺旋）还稳定的 29 聚体（见 注 25；参考文献 [ 62] )。在增加了的疏水掩埋、氢键以及极性相互作用的基础上，可以期待，当长度增加时， 盘绕螺旋结构变得更加稳定。在对设计的齐二聚肽的长度研究中（见注 26；参考文献 [63] )，这已被证明。虽然最短两个七元重复（见注 27；参考文献 [ 64 ] ) 也是需要的，在同三聚体的情况下容许结合。Lac 阻遏蛋白的盘绕螺旋结构域被用来作为检测链长对稳定和折叠的效应的基础 [ 65 ] 。毫不奇怪，四聚体的解离常数随每个螺旋 中七元重复数的增加而降低（见注 28 )。有些更令人惊奇的事实是，每个螺旋少到 4 个的七元重复协同地折叠，并没有二聚中间物的迹象。

与短盘绕螺旋相反，长的盘绕螺旋，如像原肌球蛋白和肌球蛋白重链结构域，并不在它们的核心排它性地富含大块的非极性氨基酸。更恰当地说，由于蛋白质长度所提供的稳定性，这样的蛋白质含有小的非极性或带电残基[ 66] 。这些残基约占到核心的 40%。这些不利于稳定的残基集团主要由 Ala 组成，因为这种残基比起极性残基来说对核心的稳定性损害较小（比极性侧链更容易堆积），并能增加整体的螺旋倾向性。这意味着，尽管获得正比于七元重复数的稳定性增加，但并未在这些长盘绕螺旋中观察到，从进化的观点来看，这样高的稳定性增加是不必要的。作为代替，疏水稳定的残基集团为盘绕螺旋提供必要的稳定性，而使稳定性降低的残基集团却不提供稳定性，但它们确实维持螺旋结构。这些主要含 Ala 的残基集团，在这些区域增加游变性和局部的去折叠，却不影响盘绕螺旋的整体稳定性，很可能允许蛋白质行使其独特的生物功能。

3.2.4.2 螺旋倾向

据 Litowski 和 Hodges 报道，通过把 Ser 改变为 Ala ( 具最高螺旋倾向性的氨基酸）来增加非核心残基的 a 螺旋倾向，可以稳定整个的盘绕螺旋 [ 67] 。在它们的模型----Glu/Lys 盘绕螺旋（见注 29 ) 中，这导致每个替换 0.4~0.5 kcal/mol 的稳定化。这与早先 O'Neil 和 DeGmdo 的结果相符 [68] 。这个数值小于对单个 a 螺旋的值，可能是因为维持盘绕螺旋涉及额外的稳定化相互作用。

一般来说，外部残基 b、c 和 f 应该与溶剂形成氢键，并且在同时，补偿潜在的不再能与之形成氢键的伙伴 [69] 。这些残基也负责帮助维持 α 螺旋倾向，其中每个残基都有一个构型偏好，或者稳定化或失稳化螺旋 [68] 。Ala 的 a 螺旋倾向已知是所有氨基酸中最高的，并且虽然所有普通的核心疏水残基（Asn 为例外）都有高的 a 螺旋倾向，溶液暴露的 Arg 和 Lys 也起一定的作用。这是因为 Lys 和 Arg 两者都是很好的氢键伙伴，并且非常适合用来改善分子的溶解度。确实，我们发现，螺旋倾向性在盘绕螺旋设计中是一 个重要的因素。  (http :  //ww w.   molbiotech.   uni- freiburgode/bC IPA)。

3.2.4.3 与螺旋宏偶极的相互作用

蛋白质结构中 α 螺旋组成的统计分析揭示不同的氨基酸偏好螺旋的不同部位。特别地，带负电能力的残基（Asp 或 Glu ) 强烈地偏好接近螺旋的 N 端，而带正电能力的残基（His、Arg 或 Lys) 稍弱地偏好 C 端 [ 71，72] 。解释极性侧链对螺旋末端偏好的模型可以分为两类。第一，因为 α 螺旋的头 4 个主链 NH 基团和最后 4 个 CO 基团不能与其他的主链基团形成 i→i+4 主链氢键，螺旋末端的极性侧链则可以代为氢键伙伴。这称为螺旋戴帽并在3.2.4.4 节有描述。第二，带电侧链和由单个肽骨架偶极排列形成的 α 螺旋净偶极矩之间的静电“电荷-螺旋偶极”相互作用也可以使蛋白质稳定或失稳。

( 1 ) Hodges 研究组研究了带负电的 Glu 侧链，对一个设计的、没有螺旋内和螺旋间相互作用的、齐二聚盘绕螺旋稳定性的影响的位置效应（见注 30；参考文献 [73])。在盘绕螺旋的每一个链的近 N 端，一个取代 Gin 的 Glu 在 pH 7.0 使盘绕螺旋稳定，与电荷-螺旋偶极相互作用模型相符。相反，在螺旋中部用 Glu 替换会降低螺旋稳定性，因为在 pH 7.0 相比于 Gln，Glu 的螺旋倾向和疏水性更低。在 C 端的 Glu 被替换则更加降低盘绕螺旋的稳定性，这是因为本身带有的降稳定性能力，和与螺旋偶极矩的负极间不利的电荷-螺旋偶极相互作用的综合效果。

( 2 ) 在从两个在 4 个 a 位和 4 个 g 位含 Glu、Gin、Arg 和 Lys 残基等摩尔混合物的设计的蛋白质库中挑选杂二聚盘绕螺旋时（见注 7 )，Amdt 等观察到，在选出的盘绕螺旋序列中，带负电的 Glu 和中性的 Gin 在 N 端部分的富集，以及带正电的 Lys 和 Arg 在 C 端部分的富集。这种偏好与假设的电荷-螺旋偶极相互作用符合得很好。

3.2.4.4 螺旋戴帽

螺旋可以标记为 N'-Ncap-N1-N2-N3-N4-mid-C4-C3-C2-C1-Ccap-Cy。在这些位置中，N'、Neap、Ccap 和 C' 没有螺旋的平和中角，并且 N1-N2- N3···C3-C2-C1 参与作为 α 螺旋特征的 i→i+4 氢键。残基 N1、N2、N3、C1、C2 和 C3 是唯一的，因为它们参与 i→i+4 骨架 -骨架氢键的酰胺基只使用 CO 基（在 N 端）或者 NH 基（在 C 端) ( 见 3.2.4.3 )。这些残基对形成氢键在螺旋结构和稳定性上有强有力的影响「 74 ] 。从 N4 或 C4 往上，所有残基都可以满足 NH 和 OH 骨架氢键条件。

( 1 ) 在螺旋设计中，在 N 端对稳定性最具选择性的位置是 Neap 位。对这个位置 6 个最适合的残基是 Ser、Asp、Thr、Asn、Gly 和 Pro，另外有 11 个残基（Val、lie、Phe、Ala、Lys、Leu、Tyr、Arg、Glu、Met 和 Gin ) 被完全排除 [ 75 ] 。对 Neap 的 6 个最适残基中，Ser、Asp 和 Thr 是最好的。

( 2 ) Neap 模体的一个好例子是 Ser- Xaa- Xaa-Glu  (Ncap- N 1- N 2- N 3 ) ，其中反向的侧链/主链相互作用样式（ Neap 位 Ser 的 OH 与 Gki 的 NH，以及 Ghi 的羰基与 Ser 的 NH ) 使螺旋稳定。进一步的稳定可通过 Ser- Xaa- Xaa- Glu 模体前后的疏水残基达成 [76] 。Lu 等在 GCN4 的序列中引进了这一戴帽样式，因此而使盘绕螺旋达到 1.2 kcal/mol 的稳定水平（见注 31；参考文献 [77])。

( 3 ) N1 位 和 C' 位很喜欢 Pro ( 在立体化学上是相容的，因为前面的残基具有非螺旋的骨架两面角），这确实是一个共同的螺旋终极模体，但必须避免出现在螺旋主体中，以及 C3、C2 和 Ccap 位。作为所有氨基酸中溶解度最髙的 Pro 与螺旋末端的溶液暴露位是相容的 [78] ，并且不需要氢键受体，因为它没有骨架 NH 基团 [76] 。

( 4 ) C 端戴帽模体包含骨架-骨架氢键，而不是在 Neap 和 N3 之间观察到的侧链到骨架氢键。在 C 端骨架，氢键由螺旋后骨架基团来实现（如 Schellman 模体中的 C' 和随后的 C''；参考文献 [76])。这意味着，C 端只在 C' 位需选择可以取正$角的残基，如 Gly。

3.2.5 理性设计与选择技巧

蛋白质设计的复杂本性意味着设计或预选具有高稳定性的序列是一件令人畏缩的任务。如果程序允许，宁愿生成一个相互作用库—— 可检查其序列是否有成功的相互作用的不同分子的集合。这可认为是半理性的设计，凭此可在库中引进特定位点的平衡变化（经常维持野生型残基不变），得到的大量分子组合可供筛选。正常情况下，在类似的设计中，要改变所有七元位为所有可能的氨基酸，将会产生大而不现实的库容（如果含 4 个七元重复，每个位点有两种可供选择的氨基酸，将会产生 2²⁸ = 2.68 X 10⁸ 库成员）。但如果只需产生一条待合成并测定结合强度的序列，则会是耗时且枯燥的，而且结果常会是令人沮丧的。采用半理性设计，可得到合理的折中，一个分子可以包含在库中，测试它是否确实是一个用于结合的优秀候选者，同时，提供多功能以产生新的、 非直觉的、并常常是全新的结合伙伴。在基于细胞的系统中的选择，具有更多额外的优点，可以伴随地筛选出对该有机体内的蛋白酶敏感的序列。