定量PCR原理、材料与实验方法
一．原理
应用定量PCR技术，用一种标准作对照能够估计出一种特异性靶DNA或RNA分子的相对含量。
参照物：
在定量 PCR 中必须加入参照物，用来作为扩增系统的阳性对照，并作为未知样本定量的标准，且通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率，使其具有可比性。参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。
内参照和外参照均是在定量PCR 过程中一种含量已知的标准品模板。根据参照物的不同，定量PCR分为竞争性定量PCR和非竞争性定量PCR。内参照是与待检样本加于同一反应管中，与样本共用或不共用同一对引物的标准模板。共用同一对引物者，两个模板的扩增存在竞争性，称竞争性内参照，这种条件下进行的定量PCR属竞争性定量PCR；相反，不共用同一对引物时则不存在竞争性，为非竞争性内参照，属非竞争性定量PCR。
外参照则是参照物与待检样本的扩增分别在不同的管间进行。采用外参照进行的定量PCR属非竞争性定量PCR。
非竞争性对照基因定量法：
即是靶基因与参照基因的同步扩增。是在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同一DNA 的一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们的mRNA)。此内标序列可控制DNA的量、可扩增性和管间扩增效率的变化。通过比较两种序列的扩增产物电泳带的颜色强度对靶基因定量。此法只有在靶序列和作为对照的内标序列的含量及扩增效率相似时才能得到准确的定量结果。这种扩增效率的差异常发生在 PCR 的终末期，所以zui好定量处于扩增指数期的PCR 产物。扩增后可通过测量电泳带的相对强度而定量。只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时，才能对两者进行相对定量。
竞争性PCR：
竞争PCR 与前述方法相似，即靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。对竞争性模板作系列稀释后加入到恒量的样品DNA中进行PCR，靶基因的量取决于所添加的竞争性DNA片段的量，使两者的PCR终产物有相等摩尔数。竞争PCR 有效地控制了不同反应管间扩增效率的差异。若反应条件达到要求，可不必使反应限制于指数扩增期，靶序列可在较大范围内获得定量并能检测到其2 倍的差别。因此,竞争性PCR 是应用zui广的定量PCR 方法。通过竞争性PCR 进行绝对定量的条件是靶序列和竞争序列的扩增效率相同、引物相同，靶基因和竞争基因的初始比值在整个反应过程中保持不变。
二．材料与方法
1．使用外参照的半定量PCR
1） 肝脏总RNA的提取与定量
(1) 肝脏总RNA的提取按第二部分实验一进行。
(2) 肝脏总RNA的定量
将提取的总RNA稀释一定的倍数后，用紫外分光光度计测定 260nm和280nm两个波长处的光吸收值，然后按以下公式来计算提取得到的总RNA的浓度：[RNA浓度]=A260×40× 稀释倍数 μg/ml 260nm和280nm 两处读数的比值（A260/A280），可反映核酸的纯度。DNA 和RNA 纯品的A260/A280的值分别为1.8 和2.0 如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A260/A280将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。
获得总RNA浓度后，用RNase-Free Water 将总RNA浓度调整为1μg/μl。
2）cDNA样品的制备
（1） 材料
RNA样品
（2）仪器、用具
PCR仪、电泳仪等、0.2mlPCR 管（1个）、移液器、碎冰
（3）试剂
RNase Free dH2O；5×RT Buffer(含25mM Mg2+)；dNTP(10mM each)；RNase Inhibitor(10U/μl )；Oligo (dT)20(10μmol/L)；ReverTra Ace
3） 方法
(1) 以总RNA为模板，合成cDNA*链，体系如下：
(2) 反转录反应条件为：30℃ 10min，42℃ 30min ，99℃ 5min，4℃ 5min。
注：必须将所有样品的总RNA的加样量均为 1
4）PCR
(1) 待测基因cNDA片断的获得
① 根据待测基因的已知序列设计一对特异引物，利用该引物进行PCR反应。PCR反应体系为：
② PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件
为：94℃变性1min，55℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。
(2) 外参照β-肌动蛋白cDNA片断的获得
① 根据β-肌动蛋白基因序列设计一对特异引物，利用该引物进行PCR反应。PCR反
应体系为：
② PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1min，55℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。
(3) PCR 产物经在2%琼脂糖凝胶上电泳后用凝胶成像系统及相关软件进行分析，结果以待测基因与β-肌动蛋白mRNA的RT-PCR产物亮度之比（%）表示。
2．使用竞争性内参照的定量PCR
1） 肝脏总RNA的提取与定量、组织cDNA样品的制备方法见1。
2） 竞争标准cDNA的制备
图 4－4。 竞争PCR引物设计示意图
(1) 根据待测基因序列设计一对引物（图1），用正向特异引物Primer1 和特别设计的反向
引物Primer2进行PCR扩增：
(2) PCR反应体系为：
(3) PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：
94℃变性1min，55℃退火 1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。
(4) 在1%琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳检测，方法与试验二相同。
(5) PCR产物经在2%琼脂糖凝胶上电泳分离后，将PCR产物进行胶回收。结果就得到一竞争标准cDNA片断，该片断相当于待测片断内部产生1个60bp的缺失。
3）竞争PCR
(1) 通过连续2倍稀释配制系列浓度的cDNA竞争标准，这些竞争标准cDNA梯度溶液分别加入到一定量的组织cDNA样品中（预实验确定），再用正向引物 Primer 1 和Primer 3（图1）同时扩增组织中的待测基因cDNA和竞争标准cDNA，PCR扩增体系如下：
(2) PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1min，55℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。
(3) PCR产物经在2%琼脂糖凝胶上电泳（方法与试验二相同）后用凝胶成像系统及相关软件进行分析，样品待测基因cDNA条带与竞争标准cDNA条带可据片断大小而区分并定量。根据样品待测基因cDNA 条带与竞争标准cDNA 条带亮度之比，则可利用竞争标准cDNA确定组织样品待测基因cDNA含量，再通过样品待测基因cDNA的PCR产物分子量将其含量换算成待测基因 mRNA数量。
