​ 免疫组织化学法实验——悬浮细胞的免疫荧光标记

PBSPFA固定液

多聚L-赖氨酸包被的载玻片

1) 细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机在4℃以800 g离心5 min (用于淋巴细胞）。吸去培养液并以4℃的PBS重悬细胞。

离心机转速依细胞类型进行调整，但必须低转速离心，以防止损伤细胞。除非特别说明，否则所有离心步骤均在此条件下进行。

2) 离心，吸去PBS，以1〜2 mL 2% PFA固定液，或2% PFA固定液/0. 1% Triton ×- 100重悬细胞，置冰上固定30 min。

3) 离心、吸去固定液，用15 mL 4℃的PBS重悬细胞，放置5 min,再用PBS进行第二次洗涤。使用大体积缓冲液可以减少洗涤次数。

4) 第一抗体在4℃用微量离心机以13500 g离心2 min。250μL抗体足够用于5×10⁶ 细胞。

5) 离心细胞，吸去PBS，重悬细胞于第一抗体中，置4℃温育1 h。

6) 用4℃的PBS稀释细胞和抗体至15 mL。

7) 离心，吸去PBS，以4℃的PBS重悬细胞，重复1次。

8) 第二抗体4℃用微量离心机以13500 g离心2 min。5×10⁶细胞用250μL抗体就 足够。

9) 吸去PBS，以第二抗体重悬细胞，4℃温育lh。重复步骤6及步骤7。

10) 除非立即观察细胞，否则在进行细胞最后浓缩的下一步操作之前应以铝箔包裹离心 管并冷藏。

11) 离心细胞并以少量PBS重悬（勿用水），将细胞悬液滴于多聚L-赖氨酸覆层的载玻片上，加上盖玻片，尽可能马上观察结果。