光谱FCM---工作原理
一，全光谱流式细胞仪的技术特点（以SP6800为例）：
1， 用棱镜分散发射光
2， 通过32个PMT从每个细胞获得每个染料不同波段的发射光信号
3， 具有高速，高灵敏度，准确，自动和实时的算法。
4， 具有较宽的光谱检测范围和高光谱分辨率，并可区分光谱相近的FP和荧光素如FITC（Em 519 nm）和EGFP（Em 507nm）。
5， 可以测量和减去每个细胞的自发荧光，提高的信噪比和改善弱表达指标的分辨率。
二，仪器的设计和关键部件
光谱FCM的光学示意图如图1a所示。SP6800配备488/638 nm激光器，流动池芯片，光电二极管（PD），象限PD，10个连续棱镜，微透镜阵列和32通道线性阵列PMT（32ch PMT）。 此光谱FCM捕获500 nm至800 nm多个波段荧光信号，连成光谱信息。
图1.光谱FCM的设计
a）独特光学设计：488/638 nm非共线，流动池芯片，非晶硅PD，象限PD，棱镜，微透镜阵列和32ch PMT。
b）32ch PMT中每个通道对应的波长位置。独特的棱镜光学器件实现在蓝绿色区域的通道比红色区域更密，以增加该区域中的波长分辨率。
c）流动池芯片：蓝色，绿色和粉色箭头分别标记鞘液，样品和废液流。红色圆圈标记由石英制成的检测区域。
d）检测Ultra Rainbow 8峰微球获得的光谱图。通过488nm激光激发（左）和638nm（右）分别显示获得的光谱。横坐标是500nm至800nm的波长，纵坐标是荧光强度。图表中的颜色表示每个通道对应强度的微球密度。红色表示高密度，绿色表示中，蓝色表示低。 左图32ch PMT中的第20-23个通道被屏蔽，以防止638nm激光照射到PMT中。图中的黄色箭头表示当光谱FCM以双激光模式运行时使用荧光数据的波长区域。
e）截取PE信号波长区域中的Ultra Rainbow 8峰微球获得的数据的直方图（图1d；左，橙色虚线波长范围）。根据该数据可计算仪器的灵敏度MESF和线性。 54.0和527.8分别显示来自最低强度微球（浅蓝色）和第二低强度微球（红色，紧邻浅蓝色）的平均荧光强度。
1，光学系统：
1.1， 光源
激发光光束功率分布通过聚焦透镜形成垂直于流动方向的平顶曲线，在峰值强度的80%处，宽度为40 um；沿流动方向的光束分布为高斯，1/e2处为6 um。488/638nm激光点在空间上分离，流动池芯片表面的激光功率分别为40mW和60mW，能够分别自动监控。平顶光束确保细胞左右位置些微变化时，CV依然较好。
1.2，光收集系统
十个连续的棱镜是高度透明的，涂有反射膜；之后是一个定制的微透镜阵列组件将每个光带聚焦到PMT阵列的特定通道上，从而避免荧光光子丢失到边界遮罩上；32ch PMT检测500-800nm的光。此光学系统的设计在大多数FPs和荧光染料集中的蓝绿色区域分配更多的通道实现高分辨率（图1b）。当此光谱FCM以双激光模式（488nm和638nm）运行时，32ch PMT中的第20至23个通道（617-662nm）将自动屏蔽，通过插入掩模防止638nm激光照射到PMT中。对于每个单细胞，488nm激发获得28个通道（1–19和24–32）的荧光数据，638nm激发获得9个通道（24–32），共获得37个荧光通道数据（图1d）。另一方面，在单激光模式（488nm激发）下运行时，采集32个通道的荧光数据。这种光谱数据收集允许在传统的FCM处理速率下轻松分离相近的荧光光谱而实现多色分析。32ch PMT的增益可以为每个通道单独控制，也可以控制整个32ch阵列的总电压。
通过原始物镜收集的散射光被分束器分割，再被原始分带镜进一步分割，这意味着低数值孔径（NA）分量被反射为前向散射（FSC）信号，高数值孔径（NA）分量被传送为侧向散射（SSC）信号。用非晶态硅PD检测FSC和SSC，用FSC信号可检测0.5 um到40 um的细胞尺寸。
第一反射散射信号用于使用散光聚焦算法控制Z焦点位置，以及使用象限PD跟踪算法控制液流的中心位置（图1a，橙色虚线），这种技术通常用于光盘伺服系统如CD和DVD。据此也可以确定细胞离开中心样本流的对应X和Y的坐标。因此可以自动调整细胞和激光的正交。
2，液流系统
光谱FCM采用了可更换的流动池芯片，而不是传统的石英流动室，它由塑料板和石英光学检测组件组成，以减少更换流动池芯片时的仪器停机时间（图1c）。流动池芯片的尺寸为75 mmX25 mmX2 mm，包含微流体通道，在基面上具有多个通道。有两种类型的入口，一种用于测定的样品，另一种用于鞘液，后者分为两路，通过三维流体动力聚焦用两侧鞘液流将样本流束缚于液流的中心。典型的样本流直径约为10 um，可通过单独改变样品压力和鞘液压力来控制样本流直径。
光学探测区域由石英制成，以最大限度地减少自发荧光，并高效传递光源488nm和638nm能量到达细胞上。更换式流动池芯片的优点是避免细胞和蛋白吸附的影响，保持检测区域表面的清洁。光谱FCM采用自动芯片对准机制，通过校准微球SSC信号强度和变化来检测和选择每个芯片的最佳位置，并提示何时需要更换流动池芯片，以防检测区域表面上的残留物造成不良堵塞或性能下降。
出厂时有三个鞘液流速低、中、高，分别约为3 m/s、5 m/s和10 m/s流速，样品流速分别约为18 ul/min、30 ul/min和60 ul/min。本文的所有数据均以中速采集。样本事件率约是每秒10000个（eps）。
3，电子系统
对于信号处理，在50MHz采样频率下，脉冲数据分辨率为信号高度20位和信号面积32位。通过额外的信号处理，光谱FCM不仅提供完整的光谱信息，还提供解析后的传统流式细胞术数据，展示成直方图、双参数散点图，并可以实时显示采样信号变化情况。获取的数据可以以FCS3.0和3.1的形式导出，进行或不进行光谱解混。
4，数据分析---光谱解混算法
光谱FCM根据最小二乘法（LSM），利用独特的算法自动分析获得的全光谱数据，从而实现重叠荧光光谱的分离（图2a）。我们的算法的基础如下: 从单个染色样品和未染色样品中得到的每个光谱都被认为是基本参考光谱。然后，利用每个染色和未染色参考光谱的分量，对多染色样品进行数学拟合和解混。数学上估计的系数值反映了多染色样品组成中每个光谱的贡献大小。然后，我们可以同时估计每个细胞中每种荧光素的荧光强度，而不需要任何复杂的常规补偿。
mi表示K通道的基础光谱值；y=（y1，…，yK）T表示K个通道的观测谱，其中T表示转换系数，ωi 倍增因子，e 噪声，M 荧光染料的数目，然后事件数据被表示为方程。
当只有一个荧光染料或荧光蛋白通过检测时，基谱mi在某种程度上与标准化光谱的事件数据相同。实际上，荧光光谱通常是通过统计处理从单染样品的多个事件数据的平均值计算出来的。另一方面，如果给出事件数据y和基谱mi，则ωi 倍增因子在数学上被估计。ωi 倍增因子被称为荧光强度，是FCM中最重要的数字，因为用户经常通过观察ωi的分布来判断样本信息。LSM是确定ωi的一种常用方法，它可以通过公式获得(33)。公式表达为：
因此，LSM仅通过最小化残余信号来估计所有荧光染料的贡献，并且仅根据参考光谱对每个检测通道施加相等系数的假设来计算荧光强度。
然而，众所周知，FCM数据具有异方差性，这是基于强信号通道中的较大噪声和弱信号通道中的较小噪声。为了给每个检测通道施加适当的权重，我们开发了加权最小平方法（WLSM），其中λk是在通道K的权重：
其中diag（k）是对角矩阵，在对角分量中具有λ=（λ1，…λk）T。我们还设置了一个偏移量，以避免在荧光信号变暗时使λk过大或为负值。
图2. 计算机模拟“光谱分离”和“荧光解离”的原理。
a） 光谱FCM解混算法利用所有标记的荧光素的基谱来分离得到其不同的贡献（上图）。另一方面，传统的补偿只利用窄波段的光来扣除重叠的荧光发射（下图）。
b） 488同时激发FITC和PE形成的光谱图（上图）。光谱解混前模拟数据荧光图（下图）。为了帮助识别每一个种群，有些群被标识了不同的颜色。
c） FITC/PE, APC/APC-Cy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC组合的光谱（上图）。每个荧光的归一化强度谱显示为纵坐标。由于这些模拟数据是在双激光模式下产生的，因此将20到23之间的PMT通道的强度值指定为零。分别应用LSM和WLSM算法后，FITC/PE, APC/APCCy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC组合的荧光图（下图）。为了帮助识别点图中的每个群体，有些群体被标识上不同的颜色。
d） 应用LSM和WLSM后，两种荧光染料的荧光强度比变化下的相对染色指数比较：FITC/PE, APC/APC-Cy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, 和 AcGFP/FITC。荧光比是以第二荧光染料除以第一荧光染料作为横坐标，以相对染色指数作为纵坐标。
5，计算机模拟
在计算机模拟中，基础数据集是由未染色和单染样本数据合成而成的。使用荧光微球(BD FACS 7-Color Setup Beads, BD Biosciences, CA)或绿色荧光蛋白(GFP)结合微球(AcGFP (34,35), Clontech Laboratories Inc.）,获取未染和单染数据。综合方程如下，我们定义s[k]为事件光谱，m和n为强度比。
需要注意的是，基础数据集是基于实际采集的数据，包含了与仪器和样品条件相关的各种因素影响如噪声和偏差，如激光均方根、模拟/数字转换噪声、数字滤波器、PMT电压、流速、细胞大小等。
我们模拟了四种不同的组合： FITC/PE、APC/APC-Cy7、PerCP/PerCP-Cy5.5和AcGFP/FITC。利用两种不同的算法（LSM和WLSM）对这些数据进行分析，并分析各细胞亚群的区分。相对染色指数是一个标准化的功能性指标，用于量化群体分辨率，定义如下（36,37）。相对染色指数越高，分辨率越高。
D:阴阳性群体之间的信号强度差
W:阴性峰MFI的2 SD值
