流式细胞仪常用的几种检测方法
流式细胞仪常用的几种检测方法
一、测定用乙醇固定的 DNA 的含量
1 、培养细胞的 DNA 含量的测定
制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；
加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；
附 : 细胞固定的一般步骤
1) 取单细胞悬液1～2×106 个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；
2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次；
3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；
4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。在4℃条件下可保存2~3周。
注意：
² 根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛；
² 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；
² 细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。
² 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中；
² 加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；
² 上机检测。
2 、新鲜组织的 DNA 含量的测定
1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液；
2) 500g离心5分钟；
3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中；
4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤；
5) 上机检测。
3 、石蜡包埋组织切片的 DNA 含量的测定
1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液；
2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清；
3) 加入PI液1ml室温避光30分钟；
4) 调整细胞浓度为1×106 /ml；
5) 上机检测。
二、细胞凋亡检测及相关分子检测
1 、细胞 DNA 含量分布（由细胞 DNA 降解方式检测细胞凋亡）
² 收集已固定的单细胞悬液约5×105 ~1×106 /ml；
² 离心除去固定液，3ml PBS重悬细胞;
² 1500rpm离心，5分钟 ，弃去PBS；
² 加PI染液1ml，室温避光20分钟；
² 调整细胞浓度5×105 /ml；
² 上机检测。
2 、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡
1) 常规制备单细胞悬液,用PBS洗两次.(若为全血要先溶 血),取约5×106 个细胞，1500rpm离心,弃上清,用400μl 1×Binding Buffer重悬；
2) 分成a、b、c、d、e五管，每管约1×106 个细胞
a) 阴性对照，不加任何试剂；
b) 阳性对照,加2%多聚甲醛固定30分钟,加AnnexinV 5μl,室温10min,用1×Binding Buffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μl PI避光15分钟
c) 加10μl PI，避光孵育15分钟；
d) 加5μl AnnexinV液，室温避光孵育15min；
e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液，室温避光孵育5min；
3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。
4) 上机检测。
注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；
b. 操作时注意避光；
c. 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。
3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡
1) 放置0.5~1×106 个细胞到试管中；
2) 室温离心200g，6min；
3) 弃上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；
4) 加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室温离心200g，6min；
5) 弃上清，加入20μl PE标记的Apo2.7 单克隆抗体和80μl PBSF液，用vortex轻轻震荡，室温避光孵育15分钟；
6) 加入2ml PBSF液，室温离心200g，6min；
7) 弃上清，加入1ml PBSF液重悬细胞；
8) 避光保存，直到流式细胞仪检测。
PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。
三、用流式细胞术进行 DNA 周期分析
1、方法：同DNA含量检测
2、注意：
单细胞浓度应约106 /ml，以免影响检测的CV值和检测结果；
制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量（如细胞是否聚集或过多碎片），以保证得到足够的细胞含量；
醛类固定会影响PI与核酸的结合。
四、免疫荧光标记法
1 、细胞膜上的免疫荧光检测法
间接标记法
1) 制备单细胞悬液；
2) 细胞计数，取出1×106 个细胞于试管中；
3) 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%；
4) 在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育30～60分钟；
5) PBS洗涤1～2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清；
6) 加入二抗，孵育20～30分钟；
7) PBS洗一次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;
8) 加300μl PBS，上机检测(若不能及时上机检测，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。
直接标记法
①～③同间接标记法
④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育30分钟；
⑤用PBS洗2次，1500rpm，离心3分钟，弃上清;
⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上机检测。
2 、 细胞膜内的免疫荧光标记法
间接免疫荧光标记法
1) 取已制备好的单细胞悬液，用1～3%的多聚甲醛固定30分钟（也可4℃保存过夜）；
2) 用PBS洗两次，弃上清；
3) 细胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室温10分钟；
4) 用PBS洗涤两次；
5) 加入第一抗体，室温30～60分钟，或4℃过夜，同时须设阴性对照或同型对照管；
6) 用PBS洗涤两次；
7) 加入二抗（荧光标记的抗体）室温20分钟，避光；
8) 用PBS洗涤1～2次，弃上清；
9) 重悬细胞于500μlPBS中，上机检测。
直接荧光标记法
①～⑤同间接荧光标记法；
加入荧光素标记好的抗体，避光30分钟（同时做同型对照管）；
用PBS洗涤１～２次，弃上清；
加300μl PBS上机检测。
细胞膜上及细胞内双标记法（直标法）
1) 取出已制备好的未固定的单细胞悬液1×10 6 个细胞于试管中；
2) 用PBS洗涤两次；
3) 加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原，同时加上阴性对照管，室温孵育20分钟；
4) 在试管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分钟；
5) PBS洗涤两次1500rpm 3分钟，弃上清;
6) 打孔，加入0.1％皂素200μl室温10分钟;
7) 用PBS洗涤两次，弃上清;
