在New Brunswick S41i CO2恒温摇床内采用透气袋实现人类T细胞快速扩增

摘要

近年来细胞治疗领域取得的进步大大提升了对T细胞扩增技术的需求。 T细胞必须能够迅速扩增， 才能在维持高存活率和T细胞属性的同时达到高细胞密度。 搅拌罐生 物反应器是实现大规模扩增的最佳细胞培养工具之一。 然而， 在生物反应器内进行细胞培养需接种大量细胞。 我们开发出了利用透气袋为台式生物反应器接种生产 足量T细胞的方法。
我们利用放置在New Brunswick S41i CO2恒温摇床内的透气袋进行悬浮T细胞培养， 并测试了来自不同制造商的细胞培养袋， 最大灌注量从120 mL到5 L不等。 此外， 我们还测试了不同的振荡速度， 以确定T细胞扩增的最佳条件。 由于T细胞放置在固定平台上无法生长， 所以需要适当的振荡。 我们还探索了更传统的利用振荡摇瓶 进行悬浮培养的方法。 结果表明， 使用透气袋更为成功， 不到4天其扩增量就超过了10倍， 而在摇瓶中则只扩增了2 - 3倍。 综上所述， 我们利用透气袋和CO2恒温摇 床， 建立了一种在搅拌罐生物反应器内大规模制备培养T细胞的方法。

介绍

在过去的几年里， 许多研究和开发实验室一直在研究可以实现T细胞大量生长的条件， 以支持细胞治疗应用对高质量T细胞需求的增长。 一直以来， 血库实验室进行T 细胞培养的主要目标都是维持细胞群以便后续输注。 该技术尚无法满足研发和商业使用所需的水平。 利用生物反应器培养法扩增细胞是经过充分论证的， 但还没有 针对淋巴细胞进行充分地优化。 实际上， T细胞敏感而脆弱， 既往实验都证明很难为台式生物反应器接种生产足够的细胞。
其他的悬浮哺乳动物细胞， 包括诸如干细胞等敏感细胞， 可以如前所示， 利用CO2控制的恒温摇床成功在摇瓶中培养[1]。 然而， 鉴于我们利用摇瓶法对原代人类T细 胞进行培养的初步研究并未取得成功。 因此， 我们又开发出了在New Brunswick S41i CO2恒温摇床（艾本德， S41I1200100） 中通过振荡透气袋来培养这些T细胞的 新方法。 该方法显著优化了T细胞培养， 得到了能够为台式生物反应器接种生产出足量T细胞的快速有效的初始扩增条件。 例如， 在台式研究中， 我们采用了一台 BioBLU® 3c一次性罐（艾本德， 1386000300） ,设置为最大工作容积(3.75 L)， 目标细胞接种密度为0.5 x 106 cells/mL， 则生物反应器接种总共需要1.88 x 108个细 胞。 该研究还建立了低温保存T细胞的方法， 这对此项研究至关重要。 通过建立低温保存库， 可将相同批次的细胞用于多个优化实验。

材料和方法

本研究采用一台New Brunswick S41i Co2恒温摇床进行T细胞扩增操作， 所用设备和试剂的完整列表见表1。

表1： 本研究所用设备、 耗材和试剂列表

培养基配方和恒温摇床设置
本研究的完全培养基配方包括Lonza的X- VIVO 10基础培养基（不含庆大霉素和酚红）， 还添加了5%热灭活人血清、 2 mM谷氨酰胺、 2 mM抗菌-抗真菌剂， 以及20 μg/mL IL-2。
在所有研究中， S41i Co2恒温摇床都设置为5% CO2 水平。 将悬浮方瓶中生长的T细胞培养物放置在静置架上。 在Evolve袋中生长的T细胞培养物则放置在振荡平台 上， 并利用胶带将袋子各边粘在平台上将其固定（图1）。 固定住袋子后， 将摇床设置为默认的70 rpm振荡速度（除非另有说明）。 本研究的其余部分也采用该等设定 值和培养基配方。 如图1所示， S41i Co2恒温摇床可用于多种不同的T细胞培养方法。

图1： S41i恒温摇床能够同时支持摇瓶、 悬浮T-25方瓶和细胞培养袋进行T细胞培养

优化Evolve透气袋中的T细胞解冻和初始培养
我们对从STEMCELL Technologies购得的一瓶原代人外周血全T细胞采用了两 种不同的方法进行了解冻， 两种方法都使用了ThawSTAR CFT2自动解冻仪对瓶 装细胞进行解冻操作。 STEMCELL Technologies建议将T细胞解冻至T-25方瓶， 并静置两天。 使用5 mL最大灌注量的新鲜完全培养基。 T细胞培养的头两天遵循 该方案， 然后将细胞转移至Evolve袋中继续培养。 为了确定实现最佳细胞生长和 存活率是否有必要采取静置培养步骤， 我们评估了另一种方法， 即直接将瓶装细 胞解冻至120 mL的Evolve细胞培养袋中。 在研究的这部分中采用的是80 mL工作 容积的Evolve袋。 使用Vi-CELL Xr细胞存活率分析仪每天对两种方案进行取样和 计算， 以监测细胞的生长和存活率。此外， 还使用了Life Technologies的EVOS FL 细胞成像系统检查120 mL Evolve袋内的培养物。 图2显示的是以10X放大倍数拍 摄的人类外周血全T细胞。

图2： 使用Life Technologies的EVOS FL细胞成像系统在10X放大倍数下拍摄的Evolve 120 mL细胞培养袋内的T细胞生长情况