脊髓灰质炎IgG ELISA试剂盒使用说明
1、应用范围
脊髓灰质炎IgG抗体ELISA试剂盒可用于血清和血浆中抗脊髓灰质炎特异性IgG抗体的定量检测。此试剂盒也可用来检测其它体液，您可从IBL公司获取技术支持。此试剂盒仅供体外诊断用。
实验结果从来都不可以作为医学报告的唯一依据，医学报告还得考虑病人病史和进行进一步的检测。
2、前言说明
脊髓灰质炎是一种由肠道病毒引起的传染病，它广泛流行于世界各地，并常常导致病人瘫痪和死亡。人类目前知道的人致病性脊髓灰质炎有三种类型：
1类（Brunhilde）：通常会产生严重的症状。
2类（Lansing）：出现稍微温和的症状。
3类（Leon）：少，但伴随严重症状。
脊髓灰质炎病毒主要增生扩展在肠道的淋巴节内，并通过粪便排泄出去。咽喉也可能会感染脊髓灰质炎病毒，之后病毒就会遗留在人体口腔内。人感染脊髓灰质炎后，病毒就可以通过单核细胞分布到其它淋巴节，之后在淋巴节繁殖成各种各样的脊髓灰质炎病毒。在第二个viremic阶段，病毒就停留在所有的器官和中枢神经系统的其它器官中。在90%以上感染了脊髓灰质炎的病人都不会出现任何主观症状。在其它剩余的病例中会出现：伴随低烧的非特异性疾病、头痛和喉咙发炎、痢疾、恶心和呕吐。伴随有肌肉疼痛和大脑神经的经典麻痹症非常少见。再次康复阶段要持续两年，而且常常会出现持久的破坏。脊髓灰质炎目前还没有治疗方法，仅用阿司匹林和体操的对症治疗会有些效果。在亚洲地区的很多国家中，脊髓灰质炎仍然是地方性的，但WHO已开始了巨大的工程来根除此疾病。在欧洲会有因旅游者带进的脊髓灰质炎病例存在，有时候还是致命性的。在病毒潜伏期，通过检测粪便或咽喉冲洗物中的传染原或检测血液中的抗体可诊断脊髓灰质炎。血液抗体的检测通常是通过中和检测进行的，双份血清检测有滴度差异，所以三种类型脊髓灰质炎病毒必须分别检测。最近，脊髓灰质炎IgG ELISA实验用类似白喉和百日咳的方法进行了改进，这种新的ELISA试剂盒可同时检测三种类型的脊髓灰质炎病毒。这种血清学反应是由既往感染或免疫接种所导致的。
3、实验原理
脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂采用酶联免疫的原理。脊髓灰质炎抗原包被在包被板板条的微孔上。在包被板的微孔中加入稀释好的病人血清或即用型的标准品，之后血清中的IgG抗体会结合到固相脊髓灰质炎抗原上。室温下温育1小时后，用洗涤液洗板除去未结合的物质。之后加入过氧酶标记的即用型抗人IgG，温育30分钟。之后再洗板，洗板后加入TMB底物液并温育20分钟，此时溶液变成蓝色。加入终止液终止酶反应，溶液又蓝色变成黄色，450nm处检测OD值。IgG抗体的浓度与溶液所显示的颜色强度成正比。
4、储存与稳定性
将试剂盒储存于2-8℃的环境下，有效期（标记在标签上面）内稳定。使用前，将所有成分平衡至室温（18-25℃）。不用的板条应当重新密封好，试剂瓶的盖子要盖好，并储存于2-8℃的环境下。打开了的试剂盒必须在三个月内用完。
5、样品的采集与储存
血清，血浆（EDTA，肝素）
按照静脉穿刺的常规注意事项采集样品，血液样品自采集到实验时都必须保证其化学完整性。不要使用明显溶血、黄疸和脂血样品。混浊的样品应当在实验开始前离心以除去所有的颗粒性物质。 | |||
储存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | 避免太阳直射，避免反复冻融。 |
稳定性 | 48小时 | ＞48小时 |
6、试剂盒成分
4×2ml | CAL A-D | 标准品A-d：PBS稀释的人血清，内含抗脊髓灰质炎病毒IgG抗体，另含0.01%的Methylisothiazolone和0.01%的Bromonitrodioxane，即用。 |
1×14ml | ENZCONJ IgG | 酶联物：辣根过氧酶标记的抗人IgG和蛋白缓冲液。另含0.01%的Methylisothiazolone和0.01%的Bromonitrodioxane及5mg/l的ProclinTM，即用。 |
1×12×8 | MTP | 包被板：12条8孔的包被板，包被了脊髓灰质炎抗原（纯化病毒材料的疫苗，混合有1，2，3型病毒），即用。 |
1×14ml | TMB SUBS | TMB底物液，内含TMB，即用。 |
1×14ml | TMB STOP | TMB终止液，0.5M的硫酸，即用。 |
1×60ml | DILBUF | 稀释缓冲液，PBS/BSA缓冲液，内含0.095%的叠氮钠，即用。 |
1×60ml | WASHBUF CON | 洗涤缓冲液，10倍浓缩，PBS+吐温20。 |
2× | FOIL | 粘性金属板，温育期间用来盖板用。 |
1× | BAG | 塑料袋，可重新密封，用来储存不用的板条。 |
7、实验所需材料但试剂盒不提供
1） 5ul，100ul和500ul的多道移液器。
2） 可在450nm处读数的酶标仪。
3） 洗板机
4） 用于血清稀释的试管
5） 蒸馏水
8、实验前的准备说明
8.1成分的准备
稀释/溶解 | 成分 | 稀释剂 | 比例 | 备注 | 储存 | 稳定性 | |
60ml | 洗涤液 | 加入540ml | 蒸馏水 | 1：10 | 如果有必要的话，加热到37℃以溶解所有晶体，混合均匀 | 2-8℃ | 8周 |
8.2样品的稀释
样品 | 稀释 | 稀释剂 | 比例 | 备注 |
血清/血浆 | 一般规律稀释 | 稀释缓冲液 | 1：101 | 5ul+500ul |
如果样品中的IgG浓度比最高标准品的都要高，则样品必须进行进一步的稀释。
11、实验步骤
1 | 给标准品、质控品和样品（双份检测）准备足够的板条，留一孔做空白对照。 |
2 | 将稀释好的样品、即用的标准品和质控品各100ul分别加入到相应的微孔中，留出空白孔不要加，用来加底物液。 |
3 | 盖板，室温温育60分钟。 |
4 | 弃取孔内反应液，并加入300ul稀释好的洗涤液，重复洗板3次，弃取孔内反应夜后在吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
5 | 在每一微孔中加入100ul即用型的酶联物，留出空白孔不要加。 |
6 | 盖板，室温温育30分钟。 |
7 | 弃取孔内反应液，并加入300ul稀释好的洗涤液，重复洗板3次，弃取孔内反应夜后在吸水纸上拍干以除去残余液体。 |
8 | 在每一微孔中加入100ul即用型的底物液，留出空白孔不要加。 |
9 | 盖板，室温避光温育20分钟。 |
10 | 在每一微孔中加入100ul即用型的终止液以终止底物反应，空白孔也要加底物液。 |
11 | 充分混合，450nm处读取OD值，溶液所显示的颜色60min内稳定。 |
12、质量控制
严格按照实验步骤的实验结果才是有效的。使用者必须严格遵守实验准则或其它实验标准。就如试剂瓶标签所述：所有的控制品都必须建立在一个可以接受的范围内。如果其标准不符合要求，那么实验则无效，必须重做。为了能进一步研究，每个实验室都必须知道所有的样品。如果实验背离实际结果，应检查以下参数：试剂有效期，贮存条件，取样器，实验设备，温育时间，清洗方法。
13、结果评价
平均OD值是检测OD值减去空白孔数值之后的平均值，两孔间数值的差异不能超过10%。
OD值 | 矫正后的OD值 | 平均OD值 | |
空白孔 | 0.019 | ||
标准品A（阴性质控） | 0.112/0.134 | 0.103/0.115 | 0.109 |
标准品B（临界质控） | 0.410/0.472 | 0.391/0.453 | 0.421 |
标准品C（弱阳性质控） | 1.069/1.121 | 1.050/1.102 | 1.076 |
标准品D（阳性质控） | 2.186/2.220 | 2.167/2.201 | 2.184 |
上面表格只是个例子，所有数值都是当时的温度和条件下获得的，因此上述数值不能当作参考值，参考值必须从其它实验室去获取。
13.1定量评价
脊髓灰质炎病毒IgG抗体检测试剂盒的即用型标准品和质控品用的是一个专门的单位进行定义表述的（U/ml）。如果实验结果精确并且可以重复定量评价的话，则结果有可能可以作为后续病人的质控品。质控品和标准品的浓度请见试剂瓶标签。定量检测时，用标准品和质控品的OD值对其浓度在坐标纸上进行标绘，之后每一病人样品的浓度值可以用其OD值从此参考曲线上定量得到。我们可以用计算机程序自动计算记过，浓度计算时，样品的稀释因子要重新被考虑进去。
14、特性
将弱阳性质控重复检测10次可以得到脊髓灰质炎病毒IgG试剂盒的板内差异，其板内差异小于10%。
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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