基于液滴的纳升体积的微细管蛋白结晶系统（MP...（一）

Cory J. Gerdts, Mark Elliott, Scott Lovell, Mark B. Mixon, Alberto J. Napuli, Bart L. Staker, Peter Nollert and Lance Stewart

MPCS是一项全新的半自动基于液滴的结晶技术，他可以在塑料器皿中达到纳升体积的结晶条件筛选，并且结晶体容易收获从而用于传统的冷冻和X射线衍射数据的收集。在这种塑料器皿中生长的蛋白质晶体可以直接进行下游的原位x射线衍射分析研究。MPCS能够整合结晶混合液用于结晶化实验。在微流控聚四氟乙烯管或塑料CrystalCard上大约会产生10-20nL液滴，每一个代表一批实用不同化学组分的结晶实验。结晶实验中所有的蛋白样品全部使用。在一个完整的混合（‘hybrid’）结晶实验中会联合使用稀疏矩阵筛选和化学梯度筛选。该技术有助于使用高粒度梯度筛选优化，使用优化试剂如沉淀剂，配合体或冷冻保护剂。

引言

结构生物学领域每年都会产生增加吞吐量和效率的新技术。这样的发展最初的目标是从基因到三维结构只需三天。为了提高效率，人们可能希望尽量减少所需的蛋白量，这样可以从无细胞合成种得到充足的材料用于结晶筛选和优化。正因为'three-day”结构的目标，ATCG3D致力于发展多种技术来增加基因到结构的效率，包括合成基因设计(Gene Composer; http://www.genecomposer.net/)，蛋白质晶体成像(DETECT-X; Emerald BioSystems)
和微流控纳升体积结晶 (The Microcapillary Protein Crystallization System; MPCS)。这里，我们第一次描述了MPCS的工作原型，它由微量调节注射器泵系统，泵系统的相关软件（(MicroPlugger)和塑料的CrystalCards组成，CrystalCards包括‘3+1 mixer’(这里进行试剂的结合)和微流体通道（结晶体存储）。CrystalCards的制造材料能够使X射线传输光学清晰，塑模性能和耐化学腐蚀性能和表面能量的平衡。该系统可以生产用于衍射的结晶体，可以从CrystalCards收获结晶体或使用CrystalCards上的样品衍射数据进行原位X射线衍射和结构溶解。

2.背景

我们这里讨论的微流纳升结晶技术发展于芝加哥大学(ATCG3D- Ismagilov合作实验室)。水溶液滴，这里叫做液滴（plug），微水相结合的形式，自发的流出与生物惰性碳氟化合物溶液不相溶 (Song et al., 2003; Tice et al., 2003, 2004)。蛋白质、缓冲液和沉淀剂是通过三个独立的单一通道同时流出，这里通过控制不溶的和生物惰性氟碳化合物的流量打破了水流相形成10-20nL的微配液形式的结晶 (图1a; Zheng et al., 2003; Zheng, Tice, Roach et al., 2004)。这个区域的水流称为‘3+1 mixer’。10-20nL的结晶体液滴在‘3+1 mixer’中形成，同时进行结晶体培养和检测（图1b）。通过控制流量，产生一系列很好的浓度梯度的液滴（图1c），允许检测仪仔细探测结晶相空间用于结晶体优化。基于液滴的结晶体允许使用预先形成的液滴进行稀疏矩阵筛选（Zheng & Ismagilov, 2005; Zheng, Tice & Ismagilov, 2004），通过芯片上形成的液滴混合物和结合稀疏矩阵和梯度筛选叫做‘hybrid method’ （Li et al., 2006)形成适宜的浓度梯度（Zheng et al., 2003)。后者,可以在一个单独的结晶实验中全面的筛选结晶相空间。基于液滴的微流结晶也被用于探索蛋白结晶晶核形成（Chen et al.,2005; Zheng et al., 2005; Gerdts et al., 2006）和新蛋白结构的结晶产生的科学问题（erdts et al., 2006)。

图1：使用MPCS的基于液滴的蛋白结晶。（a）结晶实验中在CrystalCard上形成的液滴。（b）MPCS CrystalCard上着色的结晶体。（c）使用low-pH buffer，high- pH buffer和universal pH buffer指示剂在CrystalCard通道（左）形成的pH梯度（右）。

3.MPCS

作为一个技术开发中心，ATCG3D开发微细管蛋白质结晶系统（MPCS）是为了发展一种基于液滴的蛋白结晶技术应用于科学研究。这个MPCS仪器主要由三个部分组成（图2）：（1）一个泵系统，（2）MicroPlugger软件和（3）CrystalCard。泵系统是一个四通道注射泵系统，可以提供精确的和连续的液流流入MPCS CrystalCard。该系统可以独立的控制每一个通道而且可以产生极好的梯度。泵由MicroPlugger软件控制（图2b）。MicroPlugger软件允许操作者通过四种不同的操作模式控制泵系统：Prime Mode (for priming the lines),Constant Mode (for constant-flow experiments), Gradient Mode (for generation of fine gradients) and Hybrid Mode (for sparse-matrix screening using the hybrid method)。这些操作模式适用于所有的MPCS实验。第三个重要的成分是CrystalCard (Figs. 2c and 2d),这是一种微流芯片，这里水和氟溶液可以在3+1 mixer中自发形成10-20nL液滴。CrystalCard的设计是一种疏水表面，用于形成液滴并且有一条很长的微流控毛细管储存和检验。用于衍射的结晶体可以通过从CrystalCard 进行物理提取或进行原位X射线衍射。有两种形式的MPCS CrystalCard：一种是塑料CrystalCard，另一种是PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard。塑料CrystalCard （图2c）主要用于fine-gradient screening，PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard（图2d）主要用于hybrid screening和detergent-based的膜蛋白形式（PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard必要的连接形式和表面属性要兼容杂交筛选和detergent-based的结晶）。

图2：MPCS组成。（a）MPCS系统组成图。（b）MicroPlugger软件操作模式截图。（c）充满着色的蛋白结晶的MPCS CrystalCard。（d）PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard用于hybrid方法。

使用泵系统、软件和CrystalCards，MPCS几分钟内会产生数以百计的不同的MPCS结晶，避免
交叉污染,只需使用5微升的蛋白质溶液。MPCS不浪费宝贵的蛋白，因为系统中没有蛋白体积的浪费：蛋白样品吸气直接进入聚四氟乙烯针，然后全部转移到CrystalCard。MPCS的另一个特征是可以形成微量体积的结晶核（Gerdts et al., 2006）和控制CrystalCard存储容器的湿度。（CrystalCards储存于加湿容器中至少可以保持两个月不变）。