cDNA宏阵列方法分离拟南芥的臭氧应答基因实验（二）

11.用 mRNA 纯 化 试 剂 盒（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 将 Poly.(A )+ RNA从总R N A 中分离出来（见注释5)。

####（2） c D N A 文 库 的 构 建

1.取1. 5 〜7. 5 μg poly (A )⁺ R N A 做模板，用 带 有 一 个 Xho Ⅰ 位 点 的 oligo-(dT)<SUB>18</SUB>引物扩增，用 Superscript H (Invitrogen， Groningen, Netherlands) 反转录酶52°C 反 应 30 min合成第一链（见注释6)。

2.第二链合成结束后，用 D N A 补 平 试 剂 盒（DNA Blunting Kit， TaKaRa Bio,Ohtsu， Japan) 将 cDNA末端补平，两端各加一个EcoRI 接头。

3.用 XAo I 消化后在cDNA 的 3 ¾ 切出XAo I 黏末端位点。

4.1 % 琼脂糖电泳分离合成的 cDNA, 大小 在 1〜3 k b 之间的片段用试剂盒(QIA-quick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Diisseldorf, Germany) 回收。

5.回收的片段通过E_CORⅠ-XhoⅠ位点连接到pBluescript Ⅱ载体上并电转化到 E.coZz'XLl-Blue MRF』 菌 株（Stratagene) 中。

####(3) c D N A 文 库 均 一 化

1.用S jtZg质粒DNA构建一个单链文库。首先，用 20单位噬菌体 F l 的gene I I 内切 酶（M13 gpn protein; Life Technologies, Gaithersburg, MD) 37°C 处理 30min (见注释7)，在质粒D N A 的 f l 复制起始点生成缺口。然后用250单位具有3'到 5'外切酶活性的外切酶m (NewEnglandBi0Iabs) 酶切得到单链质粒。整个反应在自带缓冲液中完成（TaKaRa Bio, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 5mmol/L MgCl2, 10 mmol/L 2-巯基乙醇），力口水调整至总体积50 L ，在 37°C下孵育1h。

2.用 PCR 扩增得到的 cDNA插入片段，通过加入过量的cDNA插 人 片 段（大 约 1μg）使之发生自杂交。扩 增 cDNA插入片段时，用 约 5 n g 的 DNA模 板（由步骤 1 得到的单链文库）与 I fiL 100 fxmol/L T7 引物 5'-TAATACGACTCACTATAGG0 3 』 和 1 卩 L 100 / imol/L SK 引物 5』-GCTCTAGAACTAGTGGATC-

3.混合，加人 Ex-TaqrDNA 聚 合 酶（TaKaRaBio) 在 Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler (Applied Biosystems， FosterCity, CA) 上进行 PCR 反应，反应程序如下： 7 min从室温升到94°C ; 2 0 个循环，每循环94°C I min, 55°C 2 min,72°C 3 min。最后 72°C延伸 7 min。

3.PCR产物用乙醇沉淀，溶 解 于 1.5 水 ，然后与溶于5 juL甲酰胺的单链文库 cDNA (50 ng)， 0 •5 ( 1 0 鸿）5'端 封 闭 寡 核 苷 酸 混 合 物（^GCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCG^ 和 5，-AATTCGGCACGA0 3 ' ) 和 0.5 ( 1 0 吨）3、 封 闭 寡 核 苷 酸 混 合 物（5'-CTCGAGGGGGGGCCCGGTA-3』和 5』- GTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGT A T T A - 3 ，）混合。4•混合物置于80°C 3 min, 加 人 I IOX杂交缓冲液和I.5 fxL水 ，在 30°C反应

24 h。

5.剩余的质粒D N A单链环采用羟磷灰石色谱法纯化后（1 0 ) 用 Klenow片段(TaKaRa Bio) 转化成双链DNA。然后将获得的双链D N A 电转化到£. 中。均一化的文库一般有IXlO6 个独立克隆。

####(4) 模 板 制 备 和 测 序

1.质粒DNA用碱裂解法在％ 孔板中提取（11)。

2.克隆用 A 扣1 1 和 Sma I 酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳，得到插人片段并确定片段长度。

3.BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) 对克隆进行核酸测序，在 D N A 自动测序仪（ABI PRISM 373和 377XL;Applied Biosystems) 上电泳。

4.从标准cDNA文库中随机挑选cDNA 克 隆（见注释8)。在本例中，共 有 14 026个克隆由5'端测序， 39 207 个克隆由3'端测序。最终， 39 207个 3'表达序列标签（EST) 被分成为 12 028 个独立的组（8)。

5.12 028 个独立的 E S T 克隆用来构建一个大规模的cDNA宏阵列。这 些 E S T 克隆用引 物 V-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'和 5'-TCATTAGGCA(^CCCAGGCTTTACAC-3』扩增。 PCR 反应在 Perkin-Elmer 9600 Thermal Cycler(Applied Biosystems) 上进行，反应体系为80 f/L 混合物，包 括 I jJL E.coZi细胞作为 PCR 模 板 ， I X Ex-T叫 缓 冲 液（TaKaRa Bio)， 2. 5 mmol/L MgCl2，0 •2 mmoI/L dNTPs，上下游引物各 0. 2 Mmol/L 和 0 •5 单位 Ex-Tag DNA 聚合

酶（TaKaRa Bio)。反应程序为35 个循环，每循环包括94°C解 链 45 s， 55°C 复性 45 s 和 72°C延 伸 2 min; 循环之后再72°C延 伸 4 min。

6.每个反应取4 斗 产 物 于 1. 5 % 的琼脂糖胶上电泳检测E ST片段的长度。

###3 大规模cDNA宏阵列的制备

1.剩余的 75 μLPCR 产物与 15 μL BPB 溶液混合后用 Biomek 2000 LaboratoryAutomation Workstation (Beckman Instruments Inc. , Fullerton, CA) 点在一张 8 Cm X12 cm 的 尼 龙 膜（Biodyne A ， Pall, East Hills, NY) 上。这台仪器的点样针可在膜上点出2880 个 E S T 克隆，因此，本 例 需 要 5 张不同的膜来容纳

12 028个 EST克隆。图 I A 为一张cDNA宏阵列的示例。

2.XDNA (10 mg/> μL) 点在膜上作为阴性对照。

3.点好的膜先置于装有碱溶液的浅盘中变性2 mm，再转移到中和液中反应2 min。

4.将膜用2 XSSC清洗后，有 D N A的一面向上放在纸巾上晾干。

5.膜晾干后，通过紫外交联（1.2 J/cm²) 将点上的 E ST克隆固定在膜上。

###4 cDNA宏阵列的杂交

####（1） 同 位 素 标 记（R N A S E )

1.目标样本的总R N A 或 m R N A 如 2 所述制备。在本例中，总 R N A 来自臭氧处理和未处理的拟南芥植株。

2.10 μg 总 R N A [或 0.2 μg poly A⁽⁺⁾+ R N A ] 与 2 μg  Oligo-dT_(12-18) (Invitrogen)

混合，加 DEPC 水调整总体积至14μL。

3.将该RNA溶 液 70°C 孵 育 10 min，冰 浴 2 min。

4.加人 6 μL5XM-M L V R T 缓冲液， 1.5 μL 不 含 d N T P 的 d N T P 混合液， 1μL 0.1 m o l/L D T T ， 6 μL [α<SUP>-33</SUP>P] dCTP (spec act > 2 5 0 0 Ci/m m ol; Amersham Biosciences) 和 7. 5 单位 SuperScript II (Invitrogen) 。

5.混勻后将反应混合物 37°C孵 育 90 min。冰浴 5 min。

6.将样品置于 G——50 离 心 柱（Probe Quant 0 5 0 Micro Column; Am ersham Bioscie n c e ) 中 ， 820 g■离心 2 m in。

7.收集滤液（约 30 μL) 并 于 95°C 变性,5 min。

8.将变性后的探针置于冰上直至使用。

####（2） 杂交

1.将 cDNA宏阵列膜置于杂交袋（Atto, Tokyo, Japan) 中。

2.将 IOm L 杂交液倒入袋中，用加热封口机封袋。

3.杂交袋没人 65°C 水浴中 1〜2 h。

4.将杂交袋从水浴中取出，用剪刀剪去一角。

5.将变性后的探针（3.2.1) 加入杂交液中，将袋中的空气尽可能挤净。

6.将杂交袋重新封好。

7.杂交袋没人65°C水浴中不少于 16 h。

8.杂交结束后，用剪刀剪去杂交袋一角，打开袋子。

9.将膜转移到一装有 250 mL 0. 2X SSC， 0.1% SDS 的平底塑料盒中。

10.65°C 轻轻晃动 15 min 洗 膜（见注释10)。

11.将溶液换成新的 250 mL 0. 2 XSSC， 0. 1 % SDS, 把盒子转移到 65°C 水浴中，轻轻摇晃 15 min。

12.将膜置于纸巾上吸去大部分液体。

13.用塑料包裹膜后置于成像盘（Fuji Film, Tokyo, Japan) 中不少于 12 h。

###5 数据收集和统计分析

1.用 50 p m 分辨率的高分辨率扫描仪（ Storm; A m ersh a m B io scien ces) 扫描放射自显影片，然后用A rrayV ision 软 件（A m ersh a m B io scin ces) 对信号强度定量。图 IB 为一张扫描的例图。

2.将信号强度数据以「.csv」格式导出，导入数据分析软件^ ^ MicrosoftExcel Version X， Microsoft, Redmond, WA) 进行分析。

3.用全局均一化法（见 注 释 1 1 ) 将膜与膜之间的数据差异均一化，具体做法为：将膜上所有信号的强度求平均值，用目标信号强度与膜的平均强度比值求得相对信号强度。这样，这个评估值就称之为表达率。

4.在进一步分析之前，计算重复点的表达率平均值。在筛选刺激应答基因（本例中为臭氧应答基因）时，首先去除表达率在背景信号（阴性对照 X D N A 的平均表达率）10倍以下的基因；这个表达水平相当于 0.02% 的总RNA。在本例中，这个过程排除了 12 028个 E S T 中的大约 2/3。

5.选择经处理后（ 本例中为臭氧处理，见 图 2 ) 表达量提升或下调 3 倍以上的基因做进一步分析。

6.采用单因素方差分析（显著性水平<〇. 〇 5) 鉴别出结果可重复的，对刺激产生应答的基因。这一步要用到 F 统计，即在两个或多个随机样本信息的基础上评估群体的变异，从而检验不同实验条件下 mR N A 表达水平差异的统计学显著性。在本例中，找到了 205个被臭氧调控的不冗余的 EST，其 中 157个表达被臭氧诱导， 48个表达被抑制（图 3) (12)。

7.(可选）如果有必要进行系统聚类（1 3 ) 和 K-均值聚类分析，推荐用 GeneSpring 软 件 包（version 5.0， Silicon Genetics， Redwood, CA)。

8.对拟南介数据的处理，可 以 在 Research and Tools (DART) 程序的数 据 库（http://tabacunxagr.nagoya-u.ac.jp/dart. ) 中搜索基因名和注释。基因的功目旨分类可以先通过 MATDB (http:/,mips.gsf.de/proj/thal/db/index«html) 对 E S T 分类。然后未分类的E S T 再通过注释所述中推测的功能再次分类。

###6 cDNA 子阵列的制备

当对刺激产生应答的基因被筛选出来后，制备一个筛选基因的子阵列就非常有利于进一步分析。因为一般情况下，只有约 1 0 % 的基因对目标刺激发生响应，而在进一步的实验中一个子阵列比大规模宏阵列要方便得多。子阵列一般包括 1〇〇 〜1000个基因，但是我们曾经做过一个只有 12 个基因的子阵列（14)。子阵列的用处非常多。例如，由于传统用来验证基因表达的 Northern 印迹和定量 PCR 都比较费时费力，就可以用子阵列来验证筛选出来的基因是否能正确地响应目标刺激。而且子阵列还可以用来比较突变株和不同组织间与刺激相关的基因表达差异（11)。

1.目标 cDNA克隆可以从公共资源库中或自己克隆得到。在本例中，拟 南 芥 157个臭氧诱导的EST 来自于 Kazusa DNA 研 究 所（Kisarazu， Japan)。

2.用 3. 2. 3 所述扩增条件及引物 5'-GTTTCCCAGTCACGAC-3'和 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(这对引物对应于由 pBR 衍生的质粒载体）对这些 E S T 克隆的插入片段进行 PCR扩增。

3.将 75 pL 上述 PCR 产物与 15 BPB 溶液混合，用 Multi Pin Blotter 96 (Atto)点样于 9 cmX 12 cm 的尼龙膜（Biodyne A ， Pall) 上 ，每个样本两两重复。图 3为一子阵列的示例。

4.XDNA (10 mg/fxL) 点在膜上作为阴性对照。

5.如 3. 3 所述将 cDNA 点固定在膜上。

6.如 3. 4 所述杂交并对信号强度进行定量。

7.用重复点的平均信号强度减去阴性对照（XDNA) 的平均信号强度得到每个点的信号强度。

8.选取刺激处理后表达水平未发生改变的基因的信号强度作为参照标准，对每个基因的信号强度进行均一化。在本例中，选择 AiTwM 作为均一化的标志物，因为 AtTwW 已经被证实在应激条件下表达不发生改变（5）。

注意事项

1.所有的试剂必须用电阻高于 17. 6 的双蒸水配制。

2.提取 RNA 所用的玻璃器具必须于 180°C 烘烤至少 8 h 以灭活 RNase。除缓冲液外的所有溶液都要用 0 •1 % DEPC水 配 制（见注释 3)。 RNase 的污染主要来源于实验人员的手，所以进行 RN A 实验时需要戴一次性手套。

3.DEPC 可与胺迅速反应，所以不能用来配制含有缓冲成分的溶液，比如 Tris 等。可用新鲜启封的 Tris 结晶物制备无 RNase 的溶液。

4.DEPC 可能致癌，应小心使用。 .

5.R N A 的浓度可以通过取部分终产物测 OD26。确定。 OD26 q 为 1 的溶液中含 RNA约 45 / ig/mL。

6.甲基化的 dCTP (5'-methyl dCTP) 代 替 dCTP 进 行 cDNA的第一链合成反应，防止片段内的 XAo I 位点被酶切 

7.由于睡菌体Fl 的 gene II 内切酶（M13 gpH protein; LifeTechnologies) 已经不再生产，可 以 用 位 点 特 异 性 的 内 切 酶 N.BstT9 (BIORON GmbH, Ludwigshafen, Germany) 代替。反应体系为 5 pg 质粒 DNA， 20 U N.BstT9 和N.BstT9 缓 冲 液 [BI0 R0 N GmbH, 10 mmol/L Tris-HCl， pH 8. 5, 10 mmol/L

MgCl2， 150 mmol/L KC1， I minol/L DTT， 0 •I mg/mL 牛血清白蛋白（BSA)]混合，加水调整体积至 50 ^ xL, 于 55°C反 应 30 min。

8.挑选出的克隆数量取决于基因组大小和（或）实验目的。如果要制备一套好的拟南芥 cDNA (拟南芥全基因组大小约为1. 25 XIO8 bp), 就必须要在均一化的cDNA文 库（cDNA的平均长度约为 2kb) 中挑选不少于 3 X 106 个克隆。总体上，要得到一套较好的cDNA —般需要挑选 5 倍于基因组大小的克隆。

9.当比较多套基因表达数据时，宏阵列所用的膜经常要重复使用。用 1 % SDS 煮膜 30 min 能够有效地洗脱。由于这种方法对膜的物理损伤和膜上 cDNA 量的损失 ，膜的重复使用不得超过 5 次。 Homgerg 等采用了一种较为温和的方法(I6)。由于较短的cDNA 链解链温度也相对较低，经过氧化降解后，用他们的方法可以在相对低一些的温度洗脱，这样就可以减少温度引起的损伤。根据他们文中所述，同样的膜用这个方法即使重复洗脱 10 次也检测不出损失。

10.宏阵列膜的杂交效率受探针精确度、 R N A 质量和膜反复使用的次数影响。用高质量的 R N A 和新的膜及 3. 3 所述杂交体系就可以很好地完成实验。但是当信号强度较弱或者膜用作其他用途时，建议膜的洗脱温度应低于 65°C 。例如，当以拟南芥 d D N A 文 库制备的 c D N A 宏阵列用于检测其他物种，比如芥菜(Brasska na 外《) 或 小 麦（数据未发表）的基因表达谱时，建议洗脱温度应低于 42°C 。相反，如果所有点的信号强度都很强，则可提髙温度再洗一次。

11.在 3 中，我们提出用全局均一化法来均一化阵列信号，但最近刚刚发表了一种更精确的方法（lognormal distribution fitting method) 来评估数据质量和均一化（17）