双重免疫组化实验原理及注意事项
双重免疫组化是科研中的较好的一种免疫组化方法，其原理就是根据阳性表达部位和阳性表达区域不同所建立的一种直观的多色定位的染色方法。其标记的对象是两种或两种以上的细胞部位。主要标记部位如下：
1.膜+浆型
2.膜+核型
3.浆+核型
切不可膜+膜，核+核，以免影响效果和颜色重叠。由于HRP和AEC显色系统的肉眼镜下颜色不同，所以直接抗原定位表达就非常直观了。
双重免疫组化的步骤：
1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶（198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2）室 温20分钟。
3、pH7.2缓冲液洗三次。
4、胰蛋白酶消化37 ℃，30分钟。（或按说明书要求：放入抗原修复液内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟，快速冷却；或不处理）
6、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用）
7、擦去多余血清，加一抗37 ℃，30分钟。
8、pH7.2缓冲液洗三次。
9、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。
10、pH7.2缓冲液洗三次。
11、滴加ABC或S-P复合物，37 ℃，45分钟。
12、pH7.2缓冲液洗三次。
13、DAB或（BCIP/NBT紫蓝色）显色3~10分钟。
14、pH7.2缓冲液洗三次。
15、双标阻断液，10分钟（可不用）
16、滴加正常血清37 ℃，30分钟。（可不用）
17、擦去多余血清，加第二种一抗37 ℃，30分钟。
18、pH7.2缓冲液洗三次。
19、滴加生物素化二抗，37 ℃，30分钟。
20、滴加碱性磷酸酶复合物，37 ℃，30分钟。
21、AEC显色
22、水洗
23、苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固
注意事项：
1.玻片的处理 双重免疫组化步骤繁多，两次热修复对玻片涂胶要求较 高，以免脱片。
2.由于两种显色系统颜色可能产生重叠，所以应该先让不容易显的放在前面，容易出色的放在后面。无特别说明，还是先出HRP系统，后AEC系统。
3.双重染色要有目的性，不可盲目双重染色造成结果无说服意义。
双重染色的应用：
1.用于区分常规HE染色下教难辨别的部位，例如，脉管系统中淋巴管道和 血管管腔无法肉眼区分。
2.恶性肿瘤的扩散显示。恶性肿瘤细胞的浸润在正常黏膜下呈慢性吞噬，如果对上皮和肿瘤细胞同时标记，可以更直接的观察渗透情况。
3.不同细胞在同一区域的分布情况。
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