凝血实验的标准化问题（二）
（二）凝血酶原时间（PT）的推荐方法
[原理]
将组织凝血活酶（主要含组织因子和脂质）和钙离子，加到枸橼酸抗凝血浆中，在37℃保温，测定血浆凝固时间，即为PT。PT主要用于筛选检测外源凝血系统的因子Ⅶ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ和相关因子的抑制物的试验。
[标本来集和处理]
1.标本采集：用硅化或塑料注射器抽取空腹静脉血，按9:1比例加入含0.109mol/L的枸橼酸钠抗凝剂的硅化或塑料试管中，轻轻混合均匀。
2.标本处理：以2000～2500g，离心15分钟，分离乏血小板血浆，并在24小时内完成试验。
3.正常对照血浆：选择正常健康男性和女性各lO名以上，年龄在18～45岁。但不能是妊娠、月经期、哺乳期和口服避孕药的妇女，采取的血浆冰冻干燥保存或-80℃保存。
[试剂]
1.抗凝剂：109mmol/L枸橼酸钠液（相当于含二分子结晶水的枸橼酸钠32g/L）。
2.凝血活酶试剂：市售商品，应标有ISI、批号及有效期。冻干者应按说明书加指定的缓冲稀释剂复溶。
3.氯化钙（CaCl2）溶液：为25mmol/L。（目前有些商品试剂已将凝血活酶液与氯化钙液混合好，可不必另配CaCl2液）。
4.质控物：正常及异常对照血浆
5.配制试剂用水必须符合1级纯水的标准。
[仪器]
1.手工法：秒表，保持37℃±1℃的恒温水浴箱或电热块。水深能浸试管3cm以上，表面无划痕的10×mm拭管。经标准的0.1mL移液管。经校正的秒表。
2.仪器法：各种自动或半自动血凝仪，严格按说明书操作。
[操作步骤]
1.手工法
（1）测定温度36.5～38.5℃，上述各试剂及被测血浆，均应预温至此一温度，但凝血活酶试剂预温不可超过30分钟，血浆预温一般不宜超过10分钟。
（2）所用试管及加样器等接触血浆的器具均为塑料或硅化玻璃管。
（3）吸取枸橼酸抗凝血浆0.1mL，加入一小试管中：加入凝血活酶试剂0.1mL混匀后置37℃水浴中。再加入25mmol/L
CaCl2液0.1mL，（也可先将凝血活酶试剂与CaCl2溶液等量混合，加入0.2mL）。立即混匀并开动秒表：试管仍浸于水浴中，至约10秒钟时，自水浴中取出，在纱布上迅速擦去试管外水滴，在明亮处不断倾斜试管，在流动状态下观察有无纤维蛋白形成。一旦见到纤维蛋白（同时将出现液体流动减慢），立即停表，记录时间。每次测定二管，按平均数报告。本试验的最后混合液其pH应为7.2～7.3，大部分商品凝血活酶试剂均用含缓冲液的溶液配制。
（4）每批均同时做正常和异常对照，方法应与测定标本完全相同。
[报告方式]
1.以PT的秒（S）数报告（最接近的0.5秒）
2.以患者血浆（S）/正常对照PT（S）的比率（PRT）报告。
3.在口服华法令类抗凝药物治疗监控时，应报告国际正常化比率（INR）。大部分自动化仪器可根据所测的PTR和凝血活酶试剂的ISI，自动算出INR。手工法可根据下列公式，用一计算器直接计算：
Poller设计了一个简便的列线图，在取得PTR和ISI值后，即可从图上直接查找出INR值，十分便利，国内已有介绍。
ICSH规定，不再用稀释曲线或百分比（活动度）报告。
[参考值]
因仪器/试剂不同，会得出不同结果，故很难统一规定参考值。各实验室应根据自己的仪器、试剂等条件，自行测定一批健康人，建立参考值。此后至少每年或当条件有变化时，根据新的条件，重新建立。参考值PT测定的一切条件均应与患者血浆PT测定相同（包括采血、容器、抗凝剂等）。健康供血者应选至少20个18～55岁的男性和非妊娠、月经期女性，不可服药，在平静休息状态采血、以减少个体差异（有条件时，可测一批老年人和小儿，分开统计）。同时应分开几天采血和测定，以减少天间差异。测定结果经统计学处理，计算标准差：以两个标准差（2SD）或95%可信限作为参考范围。对于三个标准差是正常还是异常，需结合具体情况进行评估。从统计学上讲，其中有些人是正常的。用以上标准，病人（PT异常）则很少会遗漏。
三、活化部分凝血活酶时间(APTT)的标准化
（一）活化部分凝血活酶时间(APTT)的标准化
APTT是检测内源凝血系统诸凝血因子缺陷和相关抑制物的筛选试验，也是当前用于凝血因子、肝素抗凝治疗以及狼疮抗凝物质检测的主要手段。
与PT测定一样，不同的部分凝血活酶、不同的活化剂和不同的激活时间对各种凝血因子缺陷、对肝素和对狼疮抗凝物质的敏感性相差很大。例如，检测APTT的试剂中，所用活化剂（白陶土、硅藻土、鞣花酸）不同，他们对检测肝素、狼疮抗凝物质和因子Ⅷ、Ⅸ的敏感性不同。
迄今，ICSH和ICTH尚未有APTT检测方法标准化或试剂标准化的可行方案问世，仅NCCLS于1992年，提出一个编号为H29-T的暂行方案。
（二）活化的部分凝血活酶时间（APTT）的推荐方法
[原理]
将一种磷脂和激活剂加到血浆中，经过孵育后，加入适当浓度的钙离子。其纤维蛋白凝块形成的时间（以秒计），即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径凝血因子的缺陷，如因子Ⅶ、Ⅺ、Ⅷ、Ⅸ、激肽释放酶原（PK）、高分子量激肽原（HMWK）以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子的抑制物测定、肝素治疗的监测以及狼疮抗凝因子的检查。
[仪器]
本实验所用仪器、设备（包括采血、贮血容器、加样装置和标本的处理等）以及对它们的要求完全与PT相同。PT所用自动化仪器同样适于本实验。
[试剂]
1.部分凝血活酶试剂：由商品供应。一般已与檄活剂按比例配在一起（或分开配制）常用的激活剂由硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagic acid）或其它可用的激活剂，由厂方配套供应。
APTT试剂/仪器结合，应能使因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ活性低于0.3μ/mL（或＜30%）的血浆，出现异常延长的结果。
2.氯化钙溶液（25mmol/L）以及其它试剂与PT所用者相同。
[操作步骤]
1.样品的采取、贮存、输送与PT测定相同。注意，应用清洁的塑料或硅化玻璃采血器采血及贮血。
2.标本（去血小板的血浆）的制备与PT相同。注意、应用去血小板血浆测定。
3.水浴箱或电热板的温度为37℃±1℃，要经常检查是否正确。
4.接触活化时间：加激活剂活化因子Ⅻ的时间要保持一致；各仪器和试剂生产厂家的规定可能不一样，应严格按说明书要求进行。手工操作时，应用秒表或类似的定时装置计时。
5.操作：预温（不超过30分钟）APTT试剂一份与预温（不超过10分钟）的侍测血浆一份混合，立即开动秒表计时；至规定的接触活化时间终点时，加人预温37℃的CaCl2液一份，混匀，同时开动秒表。至出现血浆凝固时，停表，记录血浆凝固时间（以秒计）。手工测定时应同时测定两管，按平均数报告。一些精密度已有很大改进的自动或半自动凝血仪，如果有适当的质控标准也可只测定一次。应同时测定正常和异常对照血浆。
[参考值]参照PT
[特殊解释]
1.对肝素的敏感性：APTT常用于肝素治疗的监测，通常以患者APTT与正常血浆APTT的比率在1.5～2.5作为治疗控制范围：但不同的试剂/仪器系统对肝素的敏感性不同。其试剂/仪器系统对肝素的敏感性可进行测定。体外的敏感性（in
vitro sensitlvity）是指将临床在使用的同类型钓肝素按其治疗浓度，加到正常血浆中，测定APTT。体外敏感性与体内敏感性（in
vivo sensitivity）不等同，但可作参考。
2.浪疮抗凝因子：狼疮抗凝因子是一种抗磷脂的自身抗体，由于它抗凝血的重要成分磷脂，故能干扰凝血。血中如存在狼疮抗凝因子，APTT将延长。但APTT试剂对狼疮抗疑因子的敏感性有很大差别，试剂制造厂家应提供足够的说明，有关的国家机构也可提供对狼疮抗凝因子的资抖。但要知道，病人个体之间也有很大差异，没有一种试剂能测出所有狼疮抗凝因子。
四、纤维蛋白原测定（Fg）的标准化
（一）纤维蛋白原测定（Fg）的标准化问题
纤维蛋白原（死）由肝合成，存在于血浆和体液中，其结构和功能基本已搞清，但迄今仍无理想的临床检测方法；文献报道的测定方法多至10余种，有的精密度、准确信较好，但过于复杂、烦琐；有的虽然简便、快速，但精密度、准确性较差。
1992年，英国国家生物标准及控制研究所（NIBSC）、研究完成了一个纤维蛋白原标准品，编号为89/644，向WHO的生物标准专家委员会（ECBS）推荐，[15]并被ECBC批准为国际参考品（IRP）。从此，各国均引进这一标准品来标化本国或厂家生产的次极标准品（我国卫生部临床检验中心亦已在引进）。使纤维蛋白原测定的标准化工作，走出了关键的一步。因此根据调查，各家标准品纤维蛋白原含量差别很大。
（二）纤维蛋白原（Fg）测定的推荐方法
各家用IRP来标化自己的标准时，推荐采用Jacobsson的改良法，现将该法介绍如下。
[试剂]
1.缓冲液：Na2O·2H2O 0.882g；KH2PO4 2.77gl升，此为贮存缓冲液；将贮存缓冲液l份，加生理盐水2份即为应用缓冲液，pH为6.35。
2.生理盐水：0.15mol/L
3.人或牛凝血酶：500IU/mL，生理盐水溶液。
4.凝块溶解剂：尿素400g溶于少量蒸溜水中，200mL 1.Omol/L NaOH，再加水至l升。
[操作步骤]
将纤维蛋白原冻干（标准）品（源于89/644）加lmL蒸馏水复溶，加到含有2mL应用缓冲液的有机玻璃浅盘或其他容器中，再加入凝血酶液50μL，迅速混匀，在室温中静制置2小时。将容器倒扣于吸水的布上（其下可垫吸水纸），再用适当物质（加滤纸）将凝块吸干。将凝块取下，置于5OmL生理盐水中洗涤2次，每次洗涤后均应将凝块吸干（可用玻璃挤压凝块），尽量除去含于凝块中的液体，以免液体中的其它血浆蛋白残留。必要时可在清洁棉布上挤压。
小心将凝块加人含凝块溶解剂7.5mL的容器中，摇匀，直至凝块完全溶解。倒人光径为1cm的比色杯中，以凝块溶解剂为空白，在280nm和315nm波长读取吸光度（A）。
[计算]
纤维蛋白原浓度（g/L）
式中15.87为纤维蛋白在碱性条件下波长280nm的消光系数；7.5为纤维蛋白原的稀释倍数。
当A在1.0以下时，吸光度与浓度呈线性关系。如A大于1.0，应稀释标本重新测定，重新乘稀释倍数
（三）适用的纤维蛋白原（Fg）测定（Clauss法）
[原理]
将凝血酶加到血浆中，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，血浆便出现凝固。在有足量的凝血酶时，与不同含量的纤维蛋白原作用，其出现血浆凝固的时间与纤维蛋白原含量呈负相关。
[试剂]
1.牛凝血酶l00NIHU/mL
2.纤维蛋白原标准品（IRP次级标准）
3.缓冲液（下列两种任选一种）：
（1）巴比妥缓冲液（PH7.5）；巴比妥2.5g，巴比妥钠2.75g，璐氯化钠7.3g溶于750mL去离子水中，校正至PH7.5，加水至1L。
（2）咪唑（Imidazole，或Glyoxaline）缓冲液：咪唑3.4g（0.05mol/L），氯化钠5.85g，加于约500mL水中；加O.1mol/L盐酸186mL，调PH至7.3-7.4，最后加蒸馏水至1升。
[操作步骤]
1.手工法
（1）用上述缓冲液先将标准品稀释成0.8，1.6，2.4，和4.0g/L纤维蛋白原浓度，各浓度再用缓冲液作1:10稀释。
（2）患者血浆及质控物用缓冲液作1:10稀释。
（3）将含100NIHU/mL，牛凝血酶，混匀后室温保存。如用仪器法测定，则用100NIHU/mL，牛凝血酶，不必稀释。
（4）在一试管中，加稀释血浆0.2mL，置37℃水浴中4分钟。
（5）加入预温37℃的lOONIHU/mL凝血酶液O.2mL，摇匀并立即开动秒表，不断观察凝固时间。至出现凝固时停表。
（6）每份标本测定两次，求平均数。同时测定各标准管和对照（质控）管，方法相同，准确记录时间。
（7）计算：用双对数纸作图，以凝固时间为纵坐际、纤维蛋白原浓度为横坐标，将各相应浓度的标准管对凝固时间，在图上标出相应的点并连成直线，制成标准曲线。然后根据患者和质控血浆所测得的凝固时间。在图上查到纤维蛋白原含量。
如血浆纤维蛋白原含量大于4g/L，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。如血浆纤维蛋白原含量低于O.8g/L，需将原血浆改为1:2或1:5稀释，在标准曲线上查得结果后除以5或除以2。
2.仪器法：本法可用自动或半自动凝血仪按凝血酶时间（TT）测定法测定。可自动打印出结果。一般仪器法比手工法精密度高.
