新鲜组织分离原代细胞
新鲜手术取得或冻存的组织于37 ℃ 快速复温，原代细胞培养工作液清洗3次，尽量修剪去除纤维组织，将组织块剪成约1 mm3大小的小块，弯头吸管吸取组织块均匀种植于75 cm2 培养瓶瓶底，瓶内加入少量原代细胞培养工作液，小心翻转培养瓶使组织块黏附于瓶底，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6-8 h，待组织贴壁后，正置培养瓶，补加适量培养液继续培养。每日定时观察细胞生长状况，记录细胞生长满瓶时间，并收集培养细胞送病理学检查。
①酶消化法纯化肿瘤细胞：当组织块培养15-20d后，组织块（包括无活性的肿瘤细胞、破碎细胞和成纤维细胞等）自动脱落。取出培养瓶，弃掉培养基和漂浮的组织块，用5 mL PBS 洗涤一次。加 1.5 mL 0.25%的胰酶，前后旋转培养瓶4-5次，使胰蛋白酶包被所有瓶内细胞，放入37 ℃细胞培养箱中2 min。取出培养瓶在倒置显微镜下观察，可见部分细胞首先变圆、脱落被消化下来，这时停止消化。这些首先被消化下来的细胞为成纤维细胞，吸除成纤维细胞及消化液。加入5 mL培养液，用吸管吹打细胞，收集细胞悬液。离心后弃上清。加入PBS 洗涤细胞沉淀，再离心弃上清，再加入培养液后接种于培养板中继续培养。
②机械刮除法纯化肿瘤细胞：用不锈钢丝末端插橡胶刮头或裹少许脱脂棉制成，高压灭菌后备用。用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜下，刮除无标记空间；再用PBS冲洗1-2次，洗除被刮掉的细胞；继续培养，如发现成纤维细胞残留，重复刮除至完全除掉为止。
推荐
