DEAE—离子交换剂纯化血清IgG
实验概要
本文介绍了DEAE—离子交换剂纯化血清IgG的原理及操作步骤等。
实验原理
离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离，而后流经固定相，使之与固定相上的可解离基团进行离子交换，吸附于固定相上，凡不能进行交换吸附的成分，则流出层析柱外。再根据交换吸附于固定相上的各组分解离度的差别，运用不同的pH值或不同盐浓度的溶液作流动相，流过层析柱将各组分分别再交换洗脱下来，这样混合物的各组分即被分开，达到分离的目的，此即为离子交换层析。
离子交换层析中的固定相称为离子交换剂。它是由在不溶性高分子母体上引入不同的可解离基团所构成。常用的不溶性高分子母体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖及人工合成的树脂等。引入于母体上的活性基团主要有酸性或碱性物质。由于引入的酸性物质可解离出H 离子，能与液相中的阳离子交换，故这类离子交换剂称为阳离子交换剂；引入的碱性物质可解离出OH－离子，能与液相中的阴离子交换，故将这类离子交换剂称为阴离子交换剂。
由于引入的酸或碱的强弱不同，两类离子交换剂又分为不同的型。
酸类物质以磺酸基（－SO3H）最强，引入磺酸基的阳离子交换剂称为强酸型；引入磷酸基（－PO3H2）、亚磷酸基（－PO2H）的称中强酸型；引入羧基（－COOH）、酚羟基（－OH）的称为弱酸型。
碱类物质主要是引入胺碱。引入季胺[ ―N （CH3）3 OH― ]基的称为强碱型；引入叔胺[－N（CH3）2 ]、仲胺（－NHCH3）、伯胺（－NH2）基的称为弱碱型。
各型离子交换剂的使用，将由用以分离的物质特性及分离的目的而定。
分离蛋白质（包括酶）常用纤维离子交换剂。由于蛋白质（酶）的分子量很大，在交换反应后要占有离子交换剂很大的空间位置，不溶性母体空间位置小的交换剂将无法与蛋白质交换容量很低。纤维素作为不溶性母体是因为纤维素具有亲水性强，容易溶胀；溶胀后具有舒展的长链，表面积大，使大分子特质容易接触并容纳。所以，以纤维素形成的离子交换剂对蛋白质（酶）等大分子物质的交换容量大，分辨力强，可以获得较好的分离效果及较高的因收率；另外纤维构成的离子交换剂对交换的离子吸附力较弱，用比较温和条件即可洗脱下来，不影响蛋白质（酶）等生物大分子物质的活性。纤维素的这些特点使它构成的纤维素离子交换剂在生物大分子的分离和纯化中得到广泛的使用。
纤维素上可以引入不同的解离基团而形成各型离子交换剂，其中最常用的是DEAE纤维素和羧甲基纤维素。
DEAE—纤维素（diethylaminoethyl—cellulose，DEAE）是在纤维素上引入二乙基氨基乙基，
它是弱碱型阴离交换剂。吸附蛋白质的最适pH范围为7～9，pH超过9.5，DEAE基团则不解离带电荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解离基团，与蛋白质的交换量可达75～122mg/100mgDEAE。
交换吸附于离子交换剂上的物质，通常利用改变洗脱液pH或提高洗脱液中离子强度的方法洗脱下来，从而获得较纯的特质。当在离子交换剂上吸附有几个物质成分时，可用两种方法分别洗脱下来。其一是用pH或离子强度不同的几种洗脱液分别洗脱，即在第1种洗脱液洗脱下第1个成分后，换成第2种洗脱另一成分，再换第3种洗脱液脱下第3个成分，如此洗脱下所有的成分，这种方法称为分段洗脱法。其二是在洗脱的过程中逐步改变洗脱液的离子强度，从稀到浓，逐步将各种成分洗脱下来，这种方法称为梯度洗脱法。与分段洗脱法相比，梯度法使被洗脱成分的“拖尾”现象较小，分辨率高。
应用离子交换剂来纯化物质，可以是把要纯化的物质成分交换吸附于离子交换剂上，然后再分别洗脱下来获得纯品，或者把不需要的成分吸附于离子交换剂上，需要的成分直接流出，得到纯品。本实验采用DEAE-纤维素层析柱纯化血清IgG，利用pH6.7的缓冲液溶解样品IgG，此时IgG粗物中除IgG外，其他杂蛋白均带上不同数量的负电荷，可以和DEAE上的阴离子发生交换吸附于柱上。IgG因不解离带电，而不发生交换吸附，利用此特点，让溶解后的样品流过DEAE纤维素柱，即可直接收集到较纯的IgG。
主要试剂
1. DEAE—纤维素的活化：称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。
用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生并非每次用酸、碱反复处理，通常只要“转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子，如希望阳离子交换剂带上NH 4则可用NH4OH浸泡，如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用无离子洗至pH8左右，再转型，即可再使用。
2. 0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液
3. 奈氏试剂。
4. 20%（W/V）磺基水杨酸溶液。
主要设备
1. 黑、白比色磁盘
2. pH试纸
3. 滴管
4. 洗脱瓶
实验步骤
1．装柱用0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE—纤维素，并更换1～2次。然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约425px左右为止。柱床形成后，在洗脱瓶装入0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液，接在层析柱上口，打开柱下端出口，使磷酸盐缓冲溶液流过纤维素，直至流出液的pH值与磷酸盐缓冲溶液的pH值完全相同（用pH试纸不断检查）为止。
2．上样上述平衡过程完毕后，关闭柱下口。用滴管吸去纤维素柱面上的深液（但不能低于柱下口，控制流速使样品慢慢进入纤维素内。待全部样品进入柱后，在柱床面上加一层0.0175mol/L, pH6.7, 磷酸盐缓冲溶液。
3．洗脱连接洗脱瓶，打开柱下口开始洗脱。控制流速为0.5ml/min, 用试管收集洗脱液，每管10滴。从每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盘孔中，加入1滴20%磺基水杨酸检查是否产生白色沉淀。在此条件下在收集液中首先出现的蛋白质即为纯化的IgG。因此，从洗脱开始就应收集洗脱液，直至收集液中无蛋白质出现为止（加磺酰水杨酸不呈白色沉淀），合并含有蛋白质的各管收集液中无蛋白质即为纯化的IgG溶液。
柱内DEAE—纤维素经再生转型后可再用。
4．鉴定纯化后获得的蛋白质样品均应进行鉴定后方能证明产品的合格证。
