血清γ－球蛋白的提纯
实验概要
应用相同浓度硫酸铵反复盐析法将血清中γ－球蛋白及α、β球蛋白分离，最后用透析法或凝胶过滤法除盐，即可得比较纯的γ－球蛋白。
主要试剂
1．兔血清
2．PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，Phosphate Buffer Saline）用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9％NaCl溶液。
3．pH7.2饱和硫酸胺溶液：用浓氨水将饱和硫酸胺溶液调到pH7.2。
4．葡聚糖凝胶G－25。
5．纳氏试剂（Nesser's reagent）
溶解碘化钾30克于蒸馏水20毫升内，再加入碘22.5克振摇使其溶解。于此碘液内加入纯汞30克，用力振摇之，待温度升高时，将烧瓶浸于冷水内，并继续摇匀，直到暗棕碘色转变为淡黄绿色为止。将上层溶液倾出，置于量筒内，并以蒸馏水少许洗涤烧瓶，将洗涤液一并倾入。吸取此配成之溶液1~2滴，加入1％可溶性淀粉溶液1毫升内，以试验有无多余的碘存在，如不显蓝色（即无多余碘存在），可加入碘液（碘化钾3克，碘2.5克溶于蒸馏水10毫升内配成）数滴于配成之溶液内，直至此液加于淀粉溶液内初显蓝色为止；将此溶液以蒸馏水稀释至200毫升，加10％氢氧化钠溶液975毫升，混合，即成纳氏试剂。试剂新配成呈显混浊，静置数日，待其沉淀，再吸上层清晰液供用。
纳氏试剂碱度的标定：取100ml三角烧瓶两个，加入1N HCl 20.0ml，以酚酞作指示剂，用新配制的纳氏试剂滴定，需此试剂11.0~11.5ml恰可使酚酞指示剂变成红色时最为适宜。否则必须纠正其酸碱度。
6．缩二脉试剂
称取纯结晶硫酸铜（CuSO4•5H2O）0.39g，放于小烧杯中，加蒸馏水约50ml，用玻棒仔细搅拌使溶解，将此溶液在搅拌的协助下转移到量筒中，再称取酒石酸钠钾1.2g放于小烧杯中，加蒸馏水约50ml，仔细搅拌使溶解，亦将此溶液转移到上述量筒中。然后慢慢的添加（边加边摇）2.5
N
NaOH溶液60ml，混匀，再加碘化钾0.2g，并用蒸馏水稀释到200ml。缩二脉试剂中，NaOH可保持溶液碱性，酒石酸钠钾可与Cu（OH）2
生成可溶性络合物，防止铜沉淀，KI可促进反应加速，原理尚不明。
7．20％磺柳酸（磺基水杨酸）。
实验步骤
一、盐析（Salting out）
取离心管一支加入血清2ml、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸胺溶液2ml，边加边摇，然后静止放置20分钟，再离心（3000转/分）10分钟，将上清液（主要含清蛋白）倾入试管中，留供后面实验用。
离心管底部的沉淀用1ml PBS搅拌溶解，再逐滴加饱和硫酸胺0.5ml（相当于33％饱和度硫酸胺）摇匀后再放置10分钟离心，（3000转/分）10分钟，倾弃上清液（主要含α、β球蛋白），其沉淀即为初步纯化的γ－球蛋白。（如要得更纯的γ－球蛋白。可重复这步盐析过程1~2次）。
二、脱盐（Desalting）
将葡聚糖凝胶G－25用玻棒轻轻搅拌使之悬起，倾入有尼龙布堵住下口的20Χ1cm层析柱，层析柱下口套一小段橡皮管。待全部凝胶都倾入柱内（注意凝胶要装填均匀；若分多次加入凝胶，应在放胶前将柱内凝胶顶部搅动悬起，再将疑胶液倾入），且液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡皮管夹紧，然后小心放松螺旋夹，使液体慢慢流出，到液体面全部刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再扭紧，装柱工作即告完成（凝胶为3/4~2/3柱长），可供脱盐使用。
在盛有γ－球蛋白沉淀物的离心管内，加入PBS 10滴并用玻棒轻轻搅拌，至全部沉淀物溶解后用滴管吸出γ－球蛋白液，将滴管插入凝胶层析柱内，管口靠近凝胶面缓慢滴入全部蛋白液，然后小心拧开螺旋夹，使液体流速控制在每分钟10滴左右，待全部蛋白大部分液体流入凝胶柱后，再小心加入PBS 10ml。
准备10支干净小试管用于收集凝胶洗脱液，每收集20滴换一支试管，直到全部试管都收集洗脱液后，将螺旋夹拧紧，各管留供后面试验。
准备干净瓷比色盘两块，分别于每块比色盘凹池依次加入纳氏试剂和缩二脲试剂各1滴，然后在纳氏试剂比色盘的凹池再加入收集液（Nessler's agent）1滴，检查有无NH＋。在有NH＋存在时呈黄色到橙色，记录各孔颜色变化，以（一）（＋）（＋＋）（＋＋＋）表示不呈色或呈色深浅变化。在另一块有缩二脲试剂瓷比色盘上每凹池加入收集液1滴，双缩脲反应的呈色（紫红色或紫蓝色）深浅，也用上述符号记录各管的颜色变化。
三、透析（Dialysis）
取玻璃纸（15×15cm）一张，折成袋形，将前面第一次盐析得到的含清蛋白的上清液倾入袋内，用线绳扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯内，使透析袋下半部浸入水中，对蛋白液进行透析，可将烧杯放在微量振荡器上振荡1小时以上，亦可常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，直至袋内盐份透析完毕，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4＋（方法同上述），观察透析法除盐的效果。这种方法亦可用于其它蛋白质（如γ－球蛋白）的脱盐。
