甲基化干扰法鉴定与蛋白结合的DNA位点

放射性标记DNA探针的制备

l      聚丙烯酰胺凝胶的制备

1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。

l      DNA的标记

1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5’凸出末端。酶切体系终体积50μl，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应1小时。

2．向酶切反应混合液中加入

[α－³²P]dATP（约10μCi/μl）(若5’凸末端含T残基)            10μl

dCTP(2mmol/L)                                               1μl

dGTP(2mmol/L)                                               1μl

dTTP(2mmol/L)                                               1μl

DNA聚合酶（Klenow片段）（5单位/μl）                       1μl

室温温育反应体系30分钟。

3．加入7μl 10×上样缓冲液终止反应。

l      标记探针的分离

1．将反应混合物上样于非变性凝胶。

2．10～15V/cm条件下，用0.5×TBE缓冲液电泳2～3小时。

3．将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。

4．将凝胶室温下对X光片曝光1分钟。小心操作使得显像后的X光片与凝胶能以曝光时方位复原。

5．用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记DNA片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片（约1mm²）后，放入微量离心管中。

6．向管中加入1ml洗脱缓冲液，37℃连续振荡，温育过夜。

7．将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管500μl），然后各加入1ml 100％乙醇，－80℃放置10分钟。室温离心15分钟沉淀DNA。

8．弃上清，用80％乙醇洗沉淀，室温离心5分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。

9．用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量TE中使标记探针的浓度为约10⁴cpm/μl。

甲基化反应

1．室温下，于微量离心管中建立如下列反应（每一DNA片段需6个离心管，3个用于起始反应，3个用于终止反应）

2．在1号和2号管中加1μl DMS，并加3μl 10％甲酸于3号管中起始反应。

3．将1号和2号管在16℃下放足4分钟，3号管在37℃温育15分钟。加入适量终止液终止反应。

4．剧烈振荡离心管并置于干冰/乙醇浴6分钟。

5．4℃离心7分钟。

6．用长巴斯德吸管弃上清，用1ml 100％乙醇清洗沉淀。

7．室温下离心3分钟。

8．弃去上清。

9．用干燥器或真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀，2号管的DNA沉淀用于结合反应，1号及3号管保存于－20℃备用。

蛋白/DNA结合反应

l      聚丙烯酰胺凝胶的制备

灌制5％非变性聚丙稀酰胺凝胶，用10×TGE配制TGE终浓度为1×的凝胶。

l      结合反应

1．用23μl H₂O溶解已干燥、甲基化的、标记的DNA沉淀（2号管）。

2．加入：

poly(dI-dC)•poly(dI-dC)(1μg/μl)                               2μl

蛋白提取液                                             10～20μl

结合缓冲液（10×）                                          5μl

加水至终体积为50μl

3．室温下，进行30分钟的结合反应。

4．加3μl上样缓冲液到样品中并上样5％非变性聚丙酰胺凝胶。

5．在1×TGE 10V/cm下电泳2～3小时，分离游离的和与蛋白结合的DNA片段。

6．从电泳槽中移出玻璃板并将两玻璃板分开使胶附着于一玻璃板上，用Saran®膜覆盖在胶上。

7．室温下凝胶对X光片曝光1～2小时，小心放射自显影胶片显像后，使胶片正确地与凝胶原位重合。

放射性标记DNA带的洗脱

1．用Saran®保鲜膜包裹放射自显影胶片并放在一次性白色托盘上。展开凝胶并将支撑凝胶的玻璃板放在显像过的胶片上，使得玻璃板的角和胶片的角对齐，显像后的胶片为模板，用刀将含有放射性标记DNA片段（包括游离和与蛋白结合的片段）的聚丙烯酰胺凝胶的带块切下。

2．将1.5g琼脂糖溶于100ml 1×TBE中，微波炉加热熔化后冷却至60℃时灌制凝胶，配成1.5％琼脂糖胶一块162.5px×250px×12.5px大小的微型凝胶就足以满足该实验。

3．用解剖刀在琼脂糖胶上切出12.5px×25px的小孔并用1×TBE灌满。

4．用一张12.5px×12.5px的NA45膜放在每个小孔中并保证这膜延伸到阳极。

5．用镊子将聚丙烯酰胺凝胶的小胶块放在每个孔中，可稍折小条块，使其放入孔中。用电压梯度使DNA能迁移到DNA45膜上，在1×TBE缓冲液中进行电泳，在洗脱过程中，DNA的迁移完后即可关闭电源，将小胶块用镊子移去，用盖革计数器来检测。

6．用镊子将膜转移至微量离心管中，每个管中加100～200μl洗脱缓冲液，确保每片膜能完全浸泡在缓冲液内。

7．68℃温育30～60分钟。

8．将洗脱液转移入新管中，加等体积苯酚/氯仿（1：1），剧烈振荡。

9．室温下离心5分钟相，将上层液相转至新管中。

10．  每管加入5μg经超声波处理的鲑精DNA，再加入2倍体积100％乙醇，在－80℃下放置10分钟以沉淀DNA。

11．  4℃离心收集15分钟沉淀DNA。

12．  用巴斯德吸管吸去上清，用盖革计数器检测标记DNA。

13．  用80％乙醇500μl清洗沉淀小块，振荡、4℃下离心5分钟。

14．  弃去上清，用干燥器或真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀。

DNA片段的切割和变性PAGE分析

l      变性聚丙烯酰胺凝胶（测序用）的制备

1．清洗并硅化两块玻璃板（825px×1050px和825px×975px），然后用100％乙醇轻擦表面后，将两块玻璃板的池用0.2mm厚的垫条隔开，组装好玻璃板。

2．加10％APS 200μl和TEMED 200μl至100ml变性胶贮液中，混合后立即灌入已准备好的玻璃间，插入梳子，让胶聚合1～2小时。

3．拔去梳子将玻璃板装在电泳槽中，用1×TBE加在上下槽内，用巴斯德吸管以1×TBE冲洗加样孔，在40～50W下预电泳1小时。上样前使胶预热是非常重要的。

l      切割反应

1．在每一干燥的DNA沉淀中（即样品1～4）加入10％哌叮100μl。

2．90℃温育30分钟。

3．用针在每个离心管盖子上刺一个小孔，将冷冻干燥已切割的DNA样品在真空离心蒸发浓缩器中2～5小时或直至完全干燥。

4．用闪烁计数确定每一DNA样品的契仑科夫辐射量。

5．将测序染液加到DNA样品中，使1～3号样品的终浓度为5000cpm/μl，而4号应为10⁴cpm/μl。

6．100℃处理10分钟使DNA变性，然后置于冰上冷却。

7．向40～50W预热1小时的变性聚丙烯酰胺凝胶的加样孔内上样，每个样品上5μl。

8．根据DNA片段的长度，40～50W下电泳2～3小时。

9．从电泳槽上取出玻璃板，去掉垫条使凝胶附在其中一块玻板上，小心地将一块Whatman 3MM纸板放在胶上，慢慢剥下纸板使胶附于其上，用Saran膜覆盖凝胶，80℃干燥1小时。对干燥的凝胶用X光片在－80℃下曝光过夜，以显示DNA条带。