（8）荧光显示：

　　①生物素标记DNA探针的荧光显示。

　　1）应用PBS含5%无脂干奶（5μl每张盖片），也可用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS覆盖孵育5min室温，以封闭非特异性结合部位。

　　2）移除多余液体，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm²）。在湿盒中，室温孵育20min。抗生物素-FITC在此应用是过量的，因此，可回收贮存4℃再次应用，其保存时间可达数周。反应见图20-4A直接法。

　　3）漂洗：PBs 2min×3，45℃。

　　4）如需放大（amplification）,即提高其敏感度，可按图20-4B间接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat – antivaidin antibody）30min室温。倾去加另一层抗生物素-FITC抗血清孵育20min，重复上述1）～3）。

　　②AAF标记核酸探针的荧光显示

1）封闭非特异性结合部位：从PBS中取出载片，吸干多余液体，加PBS-0.1%吐温（Tween）含2%正常羊血清（NGS）（5μl/每cm²盖玻片）。使载片停留在室温5min。

　　2）倾去多余液体，加抗-AAF抗血清1：750，PBS-Tween –NGS溶液（如上i）5μl/cm²盖玻片。室温37℃。孵育30min.

　　3）漂洗：PBS-0.1%Tween室温5min×3，间歇性振荡。

　　4）羊抗小鼠IgG-FITC孵育，1：300～1：1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS，37℃孵育30min，如3）应用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。

　　4．荧光标记DNA探针在细胞核混悬液杂交中的应用

　　（1）细胞核的分离：将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO₄染色分离方法分离细胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　）。细胞混悬液浓度为5×10⁶/ml。利用RNA酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为4～5×10⁶细胞核/ml。

　　（2）细胞固定和酸的处理：在5ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10min。在4℃离心（×150g）10min。重复加三次冷的100%酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上10min，再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO₄, 5mmol/L HEPES pH8.0）。再离心，重复IBM漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO₄。在室温静置站立10min。倾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为10⁸/ml，（可用IBM-Triton X-100稀释约50倍，在血球计数器计数），混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。

　　（3）细胞核混悬液杂交

　　①配制杂交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH调至7.0。此原液（stock solution）可贮存在4℃冰箱内。应用时加1份10mg/ml鲱鱼精子DNA（herring sperm DNA）。

　　②混合1μl的细胞核混悬液（10⁸/ml）与18μl的杂交混合液，充分混匀。将此19μl混合液移入1.5ml容积的Eppendorf 管中（核含量约为10⁵）。

　　③加入100ng/每管的AAF标记DNA探针（如为生物素标记DNA探针浓度为20～40ng/每管）。

　　④置70℃10min使DNA探针和核DNA变性。

　　⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入37℃孵育过夜。

　　（4）杂交后漂洗

　　①在每管中加入1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42℃静置10～15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加100μl经dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞（10⁷/ml）混匀，离心，室温，10min，轻弹试管使沉淀的小块散开，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，继之，静置于室温10～15min，如前离心，再加1.25ml IBM-Triton X-100,室温静置5min，离心。

　　注：DEMS处理红细胞方法：经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中，细胞含量为10⁸/ml，以K₂CO₃和DEMS溶液处理3次，第1次：K₂CO₃为20mmol/L,DEMS为3mmol/L，以后2次：K₂CO₃依然为20mmol/L，而DEMS为10mmol/L。在应用前将K₂CO₃和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中，应用100mmol/l K₂CO₃将pH调至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的柠檬酸（citric acid）/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后，用2×SSC稀释到10⁸/ml，加0.1%叠氮钠可在4℃保存至少1年。

　　（5）AFF标记的荧光显示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），轻轻振荡混匀，室温静置10min，加20μl 1：100的单克隆抗AFF抗体，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室温静置10min，加20间歇性振荡，离心，倾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡，室温静置10min，加20μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清，稀释度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25ml PBS –Tween,室温静置10min，离心，倾去上清液。

　　（6）生物素标记探针的荧光显示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10min后，加20μl抗生物素标记FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm –Triton X-100,室温静置10～15min，间歇振荡、离心。

　　（7）荧光显微镜观察：将细胞核混悬液稀释于250μl的IBM-Trion X-100中，轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上，选择适当的激发波长观察。

　　（8）流式细胞计：将750μl的细胞核混悬液通过流式细胞仪（Flow cytometry, FCM），DEMS处理过的红细胞作为对照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。详细操作见第十章　。

　　二、寡核苷酸探针的应用

　　寡核苷酸探针的优点在于它能根据需要人工用DNA合成仪合成，其长度及分子大小比较一致，可以控制。其长度一般较克隆的DNA片段短。目前，寡核苷酸探针已能成功的为放射性同位素、荧光素、生物素和地高辛所标记，并成功地运用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。虽然有些科技工作者认为其敏感度不如来自质粒扩增的cRNA或DNA探针，但由于探针制备简便再加之于近年非放射性标记的成功，寡核苷酸探针在生物基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。

　　在原位杂交组织化学中应用寡核苷酸探针，其基本操作要点是相同的，如杂交温度在Tm -25℃，杂交孵育时间以过夜（16h左右）为佳。应用寡核苷酸探针在原位杂交组织化学技术中的成功与否主要决定于探针的设计，使有效配对率增加而错配（mismatch）减少。

　　（一）地高辛标记寡核苷酸探针的应用

　　1．组织处理

　　（1）冷冻切片：厚10～20μm，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于-80℃，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。

　　（2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，以100%乙醇10min ×2，空气干燥10min，从高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每个浓度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。

　　（3）离心细胞涂片：将细胞先以4%多聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上，应用PBS（含5mmol/l MgCl₂）5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。

　　2．探针准备35pmol的寡核苷酸（oligo -）探针，3’ 终末标记以地高辛-11–dUTP。

　　3．预杂交和杂交加约300μl预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育1h。如为鲱鱼精子DNA，在应用前须在沸水浴中加热10min，而对酵母tRNA可不用加热变性。

　　（1）应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo –探针，其理想工作浓度为342ng/ml(0.342ng/μl)。

　　（2）预杂交后以2×SSC漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加30μl杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37℃过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42℃。次日室温2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室温），0.5×SSc 37℃漂洗半小时，0.5×SSC室温漂洗半小时。

　　4．地高辛显示（同前）。

　　（二）同位素标记寡核苷酸探针的应用

　　1．组织处理大鼠应用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经心脏灌注4%多聚甲醛-磷酸缓冲液中，约2h后（也可置于4℃冰箱过夜）取脑浸于同样固定液中加10%蔗糖溶液过夜，4℃。次日恒冷箱切片（-14℃），厚14μm左右，贴于有粘附剂的载片上，37℃或室温干燥以增加切片的粘附性。

　　2．杂交前处理同本章　第二节　放射性标记cRNA探针一节　。

　　3．杂交37℃过夜，余细胞同前。

　　4．杂交后漂洗2×SSc 5min×3，1×SSc 1min室温，0.5×SSc 55℃15min×2，室温漂洗于0.5×SSc 3min×2。梯度酒精脱水，切片室温干燥。

　　5．浸核乳胶切片浸入核乳胶，黑盒封闭，在4℃曝光2～3周（视同位素种类），显影，复染，观察。

第四节　原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法

　　原位杂交组化（ISHH）与免疫组织化学（IHC）结合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或两个相邻切片进行染色，这样就可以同一细胞中显示出某种mRNA和相应的蛋白、多肽或其它抗原，从而可更好地了解某一基因的转录和蛋白、多肽合成的动力学。ISHH与IHC结合法可以在相邻切片上分别进行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上进行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上进行结合法可克服这些误差，但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色过程中污染有少量RNase的液体所降解，因而在实践中往往首先进行原位杂交组化染色，这种次序使结合法易成功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失，如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。

　　一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序

　　（1）切片入PBS冲洗5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。

　　（2）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。

　　（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。

　　（4）1μg/ml蛋白酶K，37℃保温30min。

　　（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。

　　（6）PBS冲洗2×3min。

　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。

　　（8）2×SSC冲洗10min。

　　（9）杂交：如是cDNA探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液10μl于切片上，盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜，³H标记探针每10μl杂交液含1×10⁵cpm探针，³²P或³⁵S标记探针每10μl杂交液含5×10⁵cpm探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后43℃保温12～16h。

　　（10）4×SSc 37℃冲洗10～30min。

　　（11）2×SSC（如为RNA探针则含20μg/ml RNase）37℃冲洗30min。

　　（12）1×SSC和0.1×SSc 37℃分别冲洗30min。

　　（13）PBS冲洗2×5min。（转录ISHH）

　　（14）0.5%H₂O₂ PBS室温30min。

　　（15）1%BSA 37℃，30min 。

　　（16）第一抗体，4℃孵育16～24h。

　　（17）PBS冲洗4×5min。

　　（18）第二抗体37℃，1h。

　　（19）PBS冲洗3×5min。

　　（20）兔PAp 37℃，1h 。

　　（21）PBS冲洗3×5min。

　　（22）DAB显色液5～10min（DAB显色液：0.05%DAB + 0.03% H₂O₂ PBS液配）。

　　（23）PBS冲洗3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上，晾干。

　　（24）切片入70%，85%，95%和2个100%酒精脱水，空气干燥。

　　（25）在暗室涂布乳胶（乳胶配制：乳胶原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1），晾干，装入自显影暗盒。

　　（26）4℃曝光：³H标记探针4～8周，³⁵S标记探针1～4周，³²P标记探针7～10天。

　　（27）D₁₉₆显影液，20℃显影5～10min。

　　（28）自来水冲洗数秒。

　　（29）F₅坚膜定影液10min。

　　（30）自来水冲洗15min。

　　（31）切片温箱烤干，脱水，透明，封片。

　　结果：蛋白或多肽免疫反应阳性细胞为棕色胞质，而其相应mRNA为黑色银颗粒聚集。

　　二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法

　　非同位素标记物很多例如：生物素（biotin），地高辛（Digoxigenin），汞（mercury），溴（bromine）和碱性磷酸酶等，其中目前应用最多的是生物素和地高辛。将此法与免疫组化PAP法或ABC法联合使用，能成功地显示一些神经肽mRNA和神经肽的共存与共同分布。向正华等发现碱性磷酸酶抗地高辛抗体是经木瓜蛋白酶处理的，只有抗体的Fab段没有Fc段，而免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）所应用的抗体既有Fab段，又有Fc段。由于抗体的这一特性可在ISHH和ICC抗体孵育时将检测核酸的抗地高辛抗体Fab段与检测蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，这样可明显缩短ISHH和ICC结合法的实验周期，同时还可以减少实验过程中对ICC检测的蛋白、多肽的损害，使结合法易成功。为什么两种抗体可同时混合孵育切片，这是因为抗地高辛抗体只有Fab段，而没有Fc段。我们知道抗体的抗原决定簇在Fc段，因此第二抗体与第一抗体的结合是第二抗体的Fab与第一抗体的Fc，所以第一抗体如果只有Fab段没有Fc段，那么第二抗体就无法与一抗结合。因此实验中将二种抗体混合孵育切片而不会产生交叉结合。以下为此法的原理图（图20-5）。

　此种ISHH与ICC联合法稳定，实验周期短，蓝色与棕色反差强，是目前较好的ISHH与ICC结合法。详细程序如下：

　　（1）将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。

　　（2）0.1mol/L甘氨酸PBS冲洗5min。

　　（3）0.4% Triton X-100 PBS 15min。

　　（4）1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保温30min。

　　（5）4%多聚甲醛PBs 5min。

　　（6）PBS冲洗2×min。

　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配）10min。

　　（8）2×SSC冲洗10min。

　　（9）将切片用灭菌吸水纸吸干，然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12～16h。

　　（10）4×SSc 37℃冲洗30min。

　　（11）2×SSC（含RNasea 20μg/ml）37℃保温30min。

　　（12）1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。

　　（13）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

　　（14）0.5%H₂O₂ PBS室温20min。

　　（15）0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。

　　（16）碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体（Fab）与抗蛋白或多肽等抗体混合液，前者一般1：1000稀释，后者则因抗体而异。稀释液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。

　　（17）0.05mol/l PBS冲洗4×5min。

　　（18）二抗（1：100～1：200）37℃保温1h。

　　（19）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

　　（20）PAP（1：200～1：400）37℃保温1h。