WesternBlot实验方法及注意事项
实验原理：
WesternBlot印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经X光片曝光、显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料：
分离胶及积层胶溶液 、水饱和异丁醇 、1×Tris・Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物 、1×SDS电泳缓冲液 、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件 、0.75mm封边垫片 、0.75mm样品梳子 、50μl微量加样器 、恒流电源
常用试剂：
1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺
将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris・Cl/SDS,pH8.8,
在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8,补加H2O至体积500ml。用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris・Cl/SDS,pH6.8,
在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8,补加H2O至体积100ml。用0.45μm滤膜过滤溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
4）4×SDS电泳缓冲液
Tris base 24.2 g 、Glycerin 115.3 g 、20%SDS 20 ml
加水至总体积1000ml。
应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%)。
5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。
6）10%过硫酸铵
过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需癿自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)癿贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。
实验步骤：
转染后的样品，收毒，12000rpm离心，2min，去上清，细胞碎片就直接进行下面步骤：
（1）加入10 x RIPA buffer/每孔200μl，4°裂解30min。
（2）准备热变性，用八连管，每孔加入5 x loading buffer 5μl。
（3）用20μl移液枪，将裂解后的细胞取出20μl,加入对应的八连管中，并吹打混匀。
（4）封口，用PCR仪进行热变性处理：97°8min。
（5）4°储存变性后的样品，待检。
1、SDS-PAGE凝胶的配制
预先配制混合液（Tris-HCL/Acr-bis/SDS/H2O）,APS以及TEMED在配制凝胶时现加。
分离胶：用1.5M Tris-HCL 8.8、10%分离胶。（所谓的10%浓度为Acr-Bis的浓度，即丙烯酰胺的浓度，用水定容，其他成分不变）；浓缩胶：用1M Tirs-HCL 6.8、浓度：5%。
2、上样电泳：
所用梳子为15孔，Marker占用一孔，故每块凝胶可以检测14支样品。上样量：Marker：5 μl/孔； 样品：20μl/孔；参数：80V，待样品跑出上样孔；120V，样品进入分离胶；200V，直至结束（蓝色指示带到凝胶底部即完成电泳）
3、转膜：
转膜三明治结构顺序：黑色板、网垫、一层滤纸、凝胶（习惯将Marker放在右侧）、NC膜（在膜的蛋白面左上角做好标记）、两层滤纸、网垫、白色板。
备注：所用的滤纸也分粗糙面和细腻面，细腻面对着凝胶和NC膜，粗糙面对着网垫。将三明治结构的夹子放入电极时，黑色板对应电极的黑色一面（负极）、白色版对应电极的红色一面（正极）。
强调：凝胶和NC膜（硝化纤维素膜）的顺序千万不要放反，所用的NC膜分粗糙面和光滑面，粗糙面为接受蛋白面，该面和凝胶直接接触。盖槽盖时，同样注意黑色对应黑色、红色对应红色；同样导线电极连接电源的时候，也是黑色对黑色、红色对红色。上述任何一步弄反，都会导致蛋白转膜失败，切记。
转膜所用参数：稳流45mA，过夜（999min）。
4、封闭
所用封闭液：5% Nonfat milk，用TBST配制，RT（室温），30min~1h（根据实际情况确定时间，比如封闭液已使用次数、ECL显色的背景）。为了防止奶粉变质，加入叠氮钠即NaN3（一种光谱的防腐剂），终浓度为0.02%（本实验室叠氮钠储存液浓度为2%）
洗：TBST，洗去残余的奶粉。
5、一抗孵育
所用抗体：mouse，Anti-Flag。
一抗稀释：4%BSA by Super Block，1:1000。亦加入0.02%的叠氮钠NaN3。
孵育：RT，约3h。
洗：TBST，3 x 5min
6、二抗孵育
所用抗体：HRP，anti-mouse。
二抗稀释：5%Nonfat milk by TBST，1:2000.（二抗一般用两次或三次就更新）（强调：二抗中不可以加NaN3，,因为其会抑制HRP的活性）
孵育：RT，1h。
洗：TBST，6 x 5min。
7、显色：ECL。
A液/B液，各取300μl等体积混合，现用现配。用荧光笔标记好NC膜上的Marker以及上样孔的位置。将反应液均匀的加到膜上（蛋白面），浸湿整张膜，然后轻轻的将膜的蛋白面向下放入显色仪，盖上盖子，点击开始。
注意事项
1、开始配胶的板子一定得夹紧，防止漏胶。
2、上样的板子也得夹紧，防止漏电缓液，在跑胶出现胶的快慢不一样，原因上样前两块胶的板子没有加紧漏电缓液，还有就是胶的浓度不一样。
3、上样时，marker5ul加5 x loading buffer混匀一起上样，这样可以防止在跑电泳的过程，样品把marker给挤的越来越窄。
4、转膜时，NC膜的正面左上角先用marker笔做好标记，防止后面孵育抗体与显色的过程分不清NC膜的正反面。
5、转膜之前，先把NC膜放在转膜液浸泡，注意从一端慢慢的往下浸泡，否者NC膜容易泡不透，影响转膜。
6、显色时，往NC膜上加转膜液也得从一边慢慢往下加，否者最后显色效果也不好。
7、转膜时，NC膜与胶的接触之前千万不可有气泡，否者对结果的目的条带有影响。
