三、以AD发病的遗传学为基础的转基因动物模型

（一）Aβ假说

自从Alzheimer于1906年首次报道进行性记忆和认知功能减退的AD患者以来，以发现者名字命名的该疾病一直困扰着人们。Alzheimer注意 到病人的大脑有NFT和血管外的SP病理改变，但不能区分这是致病因子或仅仅是疾病的标志物。直到20世纪末，随着分子生物学方法及相关科学的进步，才使 人们加深了对AD的认识。1991年在基因相关分析研究中人们发现了重要的线索：β淀粉样蛋白前体（Amyloid beta-protein precursor，APP）基因的错义突变会导致常染色体显性遗传的家族性AD（FAD）的发生，这些突变发生在APP的Aβ编码区[14]。随后又发 现与AD发病有关的其他3个基因，分别是14号、1号和19号染色体上的早老素1（prsenilin-1，PS1）基因、早老素 2（prsenilin-2，PS2）基因和载脂蛋白E4（apolipoprotein E4，apoE4）基因[15，16，17]，它们的突变或多态型会使AD发病的危险性增加。APP、PS1和PS2基因主要与FAD有关，FAD病人至 少有其中之一的异常，大约10%的FAD和2%散发性AD存在APP基因突变，而PS基因突变的患者则高达40%～50%[17]。ApoE与FAD和散 发性AD都有关。与FAD相联系的每一个基因改变以及从基因型到表型的改变的阐明使人们形成一个共识，即至少FAD的形成是这样开始的。故而人们把研究目 光转向了形成SP的主要成分Aβ上，经过一系列的研究之后，在其代谢的关键酶α、ß、γ分泌酶（secretase）的确立及其代谢的分子机制方面取得了 一些进展。这些新发现加上Aβ易于形成具有神经毒性的蛋白，导致大脑神经元功能障碍，出现AD相应临床表现。一种疾病发生发展过程的粗略轮廓开始浮现，逐 渐形成了AD发病的Aβ假说，该学说认为各种病因最终作用的结果是引起Aβ代谢异常，表现为Aβ过度产生，降解减少，Aβ聚集或沉积，引发各种免疫炎症反 应和神经毒性级联反应，导致广泛的神经元变性和细胞功能障碍、突触缺失及因凋亡或死亡引起神经元减少等一系列的病理生理变化，最终导致AD发生。因 此，Aβ沉积是AD发病机制的始发因素和中心环节[18]，自然成为AD研究的主要方向和热点，同时也为治疗AD带来了新的药物作用靶点。

（二）转基因和AD转基因动物模型

人们发现AD以上基因突变的同时，便开始借助新出现的转基因技术，将已发现的人类的4个突变的外源性基因转入动物体内来制备转基因动物模型，这已成为动物 模型制作中一个比较新的方法，该方法将FAD相关的人类突变基因转入动物中，并使外源性基因稳定遗传，改变动物遗传学性状，达到在动物体内模拟人类FAD 遗传特征的目的，并以此来筛选针对Aβ靶点的AD治疗药物。

转基因是将外源性基因引入基因组，并使外源性基因稳定遗传的方法。在过去的15年间，外源性基因转入哺乳动物基因组已成常规实验操作方法。传统的方法是将 目的基因通过显微注射导入单细胞受精卵中，存活的受精卵移植到假孕动物的子宫内发育成个体。部分受精卵在尚未分裂时，外源性DNA已整合、进入动物染色体 组。由这种卵发育而成的动物，由于其外源性基因整合进了生殖细胞，因而能稳定地将外源性基因遗传给子代。随着胚胎干细胞（embryonic stem，ES）技术的出现，以及同源重组基因打靶策略的发展，研究者能探寻特定基因的功能，并且能弄清楚基因的精细改变对基因功能的影响以及在体内产生 的特定效应。这种新的有效转基因技术是首先建立ES细胞系，从发育中的囊胚内细胞团中取出细胞，在滋养层上或有分化抑制活性的培养基上传代以维持去分化状 态，然后通过电击、转染、微注射等方法将外源性基因转入ES细胞，细胞经筛选后再送入囊胚，囊胚移植入假孕雌性动物体内发育成个体。这样出生的个体与传统 的单细胞受精卵经显微注射的个体相比，多为嵌合体，因为携带转入基因的细胞只占整个囊胚的一部分。只要携带有外源性基因的细胞能发育成生殖系细胞，通过育 种就可以建立转基因系。将外源性基因导入ES细胞要优于单细胞受精卵的显微注射，因为可以设计外源DNA，使之与内源的同源序列发生同源重组。 Southern blot或PCR筛选后，可以鉴定出正确打靶的ES细胞克隆，经囊胚注射入宿主囊胚后发育成所要的嵌合体。

转基因动物可在体内研究某一特定致病基因的作用，是研究AD独特而重要的模型。转基因动物分为两类，第一类是含有无效基因的小鼠——基因敲除鼠 [19，.20]。它们通常用于了解敲除的基因在AD病因中的功能，与此同时它们可以再插入相关的人类突变型基因，以避免内源性小鼠基因可能的干扰作用。

第二类是AD转基因小鼠表达AD突变的致病基因，从而表现出相关的AD表型的病理特征，通过对已存在的AD转基因小鼠相杂交，附加额外的基因或因此来创造 转双基因或多基因的小鼠。这样使得人们能对这些不同AD相关因素的相互作用进行研究[21，22]。基于遗传背景、繁殖能力、操作难度和经济等方面考虑， 目前的转基因动物多选用小鼠。现有多种转基因小鼠均可表达与AD病变有关的基因如APP、APP的C末端片段、tau、PS1、PS2、ApoE等。

1.制备Aβ沉积的转基因小鼠所需要的参数

在构建一个转基因小鼠时，启动子的选择对于决定其时间和空间的表达模式及基因的拷贝数起重要作用。小鼠转APP和PS1基因的表达有15个不同的启动子。 这些小鼠已成功的复制出AD的一些病理特征，如Aβ的过量产生和淀粉样沉积。有些也通过转基因启动子产生并得到普遍应用，如APP启动子[23]、朊病毒 蛋白启动子[24]和PDGF-β[25]，均导致神经系统以外的一些表达，而Thy-1[26]启动子则是神经元特异表达。启动子的选择同样影响到成功 复制Aβ沉积建立转基因小鼠所需要的一个参数——转入基因的过度表达。早期的转基因鼠系使用的是FAD的APP等位基因，但并没有显示出AD的任何病理特 征。这是由于转入APP基因的过低水平，大概只有内源性鼠APP基因的1.3到1.4倍造成的[27]。

第二是鼠系的选择问题，因为至少8个不同的鼠系被用来制作过度表达APP的转基因小鼠[24，26]及表达PS基因（PS1和PS2）[28]。除了 APP和PS1转基因鼠系产生于FVB/N株系[15，47，72]，所有的其它转APP和PS1的小鼠都是建立在杂交鼠系上。杂交鼠能制造出更大的容积 并且有更强健的胚胎[29]。转基因所用的鼠遗传背景将对鼠系的维持和行为测试结果有明显的影响。由于杂交鼠系携带有一些不良的特征，转基因动物使用这些 鼠系时，将会带有这些特征。这些不良特征包括FVB/N，CBA和C3H遗传背景中的视力受损，DBA和129鼠背景中肿瘤的高发性，SJL杂交鼠系有一 更高水平的攻击性和C57鼠出现年龄依赖耳聋[30]。另外，C57鼠显示出年龄依赖的病理损害聚集，和淀粉样沉积相似，但能与其分辨开来[31]。含有 这些损害特征的杂交鼠在依赖视觉系统的学习记忆测试中，如Morris水迷宫中会影响其成绩。对于行为学测试包括学习记忆，最好的鼠系选择却是 C57B1/6J杂交鼠系。这个鼠系能较好适应Morris水迷宫、八臂迷宫和条件空间变换测试[29]。Carlson等[32]在研究小鼠的遗传背景 对其表型的影响时，发现具有B6xSJL杂交遗传背景能产生SP的Tg2576小鼠回交至C57B1/6J鼠时，每一个杂交的后代转基因的传递和子孙的存 活率都降低了。C57B1/6J背景使转APP基因小鼠的生存能力降低，其能力在Borchelt等培育的APPswe小鼠和C57B1/6J鼠系之间， 资料表明遗传背景对存活状态、行为及与APP过度表达相关的病理都有明显的影响。

在成功复制Aβ沉积的转基因小鼠模型建立以前，人们预测存在以下一些问题：转入基因的异位表达，完全APP异构体缺乏和APPs-α下调的缺乏。为了解决 这些潜在的问题，酵母人工染色体技术(yeast artificial chromosome，YAC)被用于产生转基因鼠系。Lamb等[33]通过导入编码人类APP基因400-kbp DNA建立起转基因小鼠，该类小鼠采用正确表达模式表达所有的APP剪切体亚型；第二个问题是，在小鼠中可能仅仅是复制出正常APP的水解和APPs-α 产量的减少。APPs-α已报道具有神经营养作用[35，36]和神经保护作用[37]。为了验证这个假说，人们将含有瑞典突变Aβ的序列代替转基因鼠系 中的Aβ序列 [38]。这个方法的优点是没有增加APP的表达，其表达未超过正常水平并且没产生外源性APP表达。与正常人类衰老的大脑相比，一个1.3到4.5月月 龄的这种转基因小鼠大脑内的Aβ产量增加9倍。当APPswe突变存在时，估计这些小鼠的APPs-α产量可能减少。人们已在这些小鼠中观察到，Aβ产生 增加和APPs-α分泌减少在神经元存活方面有潜在作用。进一步的证据表明，减少APPs-α分泌可能在成功复制AD小鼠模型中起作用。最近的一项研究表 明，在Swiss小鼠脑室内注射APPs-α能提高记忆能力[39]。因此，在将来的转基因鼠研究中应当审慎地去监测Aβ增加和APPs-α减少的潜在神 经病理作用。