简介

对于药物研发早期先导化合物寻找和确认，配有发光蛋白检测应用的FLIPRTETR是简便且可信赖的高通量筛选系统。发光蛋白检测部件包含了增强型CCD (ICCD) 相机和悬浮细胞系统。ICCD相机的增益可调节功能使得FLIPR^TETRA系统既可以适应基于染料的明亮的荧光实验，也可以记录信号强度较弱的化学发光蛋白实验。本篇应用文章描述了贴壁CHO Mito-Photina®/H3发光蛋白细胞在FLIPRTETRA系统中的实验结果和表现。

关于mito-Photina细胞系

CHO mito-Photina/H3是由Axxam SPA (Milan, Italy)提供的细胞系，表达了线粒体靶点去辅基发光蛋白和 G蛋白偶联受体组胺3 (H3)，连同了Gαq蛋白。与腔肠素孵育时，Apo- Photina在细胞中表达形成了一个激活的Photina 分子，其在结合GPCR被激活引起的细胞内钙离子流后可以发射出蓝色光。 化学发光检测型 ICCD 相机可轻易地检测出Photina细胞发出的高相关光单位 (RLU)信号，无需相机饱和。使用相机的增益可调节功能使得FLIPR^TETRA系统同样可以检测很低的光信号并且在化学发光实验中所需细胞数量较少，减少了细胞培养方面的需求。

材料

培养基：Dulbecco’s MEM/ 营养素混合F-12并添加了HEPES (Cat. #11039-047), 1.35 mM 丙酮酸钠 (Cat. #11360- 070), 10% FBS (Cat. #10082-147), 1%青霉素/链霉素(Cat. #15070-063)。500 μg/mL遗传霉素(Cat.#10131-027)。1% L-谷胱甘肽 (Cat. #25030-081), 均来自Invitrogen公司。

Versene (Invitrogen Cat. #15040-066)

不含钙镁离子的PBS (Invitrogen Cat. #14190 或类似溶液)

 0.05% 含EDTA的Trypsin (Invitrogen Cat.#25300-054)

天然的腔肠素（细胞提供者建议）

BSA Media: DMEM/F12 （不含酚红），含15 mM HEPES (Invitrogen Cat.#11039-021)，0.1% BSA (Fraction V heat shocked, low endotoxin, low protease (Sigma Cat. #A6003 或类似物)  Water for injection (Irvine Scientific Cat.#9309 or equivalent)

Tyrode Buffer (pH7.4)—alternate for BSA Media (all chemicals from Sigma): 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM

384-well 黑壁底透记录板（Corning Cat. #3172 or equivalent)

方法

发光蛋白的化学发光实验中涉及到细胞、化合物和仪器的准备。仪器设置在表1、2、3中有相应的描述。更多的信息可以参照FLIPR_TETRA系统使用说明书中化学发光实验方案的7.13章节。

细胞准备

第一步：实验前，复苏细胞并在筛选抗生素条件下培养，遵照细胞提供者的指导方案操作。

第二步：开始实验前的一天用trypsin从flask中消化细胞

第三步：在无抗生素的培养基中，按照每孔2500-10000个细胞在384孔黑壁底透的记录板上种上细胞。37°C 和5% CO₂过夜培养。

第四步：实验当天上午，去除记录板孔中的培养基。

第五步：在光照强度弱的环境中，每孔中加入25 μL BSA培养基或含有5 μM 天然腔肠素的替代培养基。

第六步：盖上板盖，然后包上锡箔纸以避光，然后在22℃或更低温度孵育4-6小时以优化腔肠素反应。

化合物板准备

化合物板能包含足够的体积满足3-4个记录板的需求。准备384孔的聚丙烯化合物板并预留足够的体积避免向细胞板移液时产生气泡。