一种利用表面等离子共振定量流感病毒的新方法...（六）

讨论

在本文中，我们展示了一种新颖的定量HA的生物传感器方法的开发和初步结果，它利用了与SRID方法相同的参照抗原和血清，再加上固定的HA。

来自不同供应商的重组HA蛋白经过固定化的测试，并根据固定性质(如活性和直接稀释到固定缓冲液的高浓度)进行挑选(数据未显示)。挑选出的蛋白可利用标准的氨基偶联步骤，在接近中性(pH 6.5-7.0)的缓冲液中轻松地进行固定化。其它蛋白固定化试剂，如通过活性二硫化物[29]或蛋白上引入的醛基来偶联，也能产生活性表面，只是随时间的稳定性比胺偶联方法所获得的稍逊(数据未显示)。除了利用表面上的重组HA，初步研究显示单价疫苗(MBV)，特别是亚基或裂解疫苗，也可以固定并得到相似的定量结果(数据在别处显示)。MBV可能成为表面物质的更可靠来源，因为疫苗制造商会在年度生产中确保其供应量。

用较早期的血清来获得初步定量的可能性。亚型特异性分析结果以及定量的高度准确性(或许这更为重要)  (图3，表1和4)表明再生不会分析性能产生负面影响。利用这种再生，经历>100次样品/标准品处理也依然可以保持其对所有三种亚型足够的结合活性从而进行可靠地定量。表面活性剂P2O(Tween 20)包含在所有溶液中，因为已知它能在不影响相互作用分析的前提下防止蛋白吸附在流动系统中，从而使原始样品得以进行分析。而且，研究表明非离子型去污剂的添加有助于防止HA聚集[33]。针对H3N2利用两个随机选择的毒株(New York和Wyoming)来简单研究其毒株特异性。正如由遗传差异所得预期，两种血清和参照抗原对另一毒株表现出不同的结合模式(图6)。当抗原和血清都是Wyoming时，此组合所获得的灵敏度最高。这反映出这些试剂比NewYork试剂具更高的亲和，从而导致对表面结合产生更有效的抑制，而不是因为固定的HA是Wyoming。采用与分析样品毒株不同的参照抗原和血清，可获得不同的绝对浓度。不过，工艺开发中产量的比较并不一定需要绝对浓度。可以通过进一步研究来探索毒株间的遗传相近性所决定的这种差异的相关性。蔗糖(>1％)和氯化钠(>0.2 M)在可靠性测试中确实干扰了所测量到的响应。蔗糖和盐浓度升高，响应降低(使HA浓度计算值增加)。已知在超出生理条件下盐浓度的增加会削弱抗体与抗原的结合。在疫苗纯化过程中，常使用蔗糖梯度和层析柱，获得蔗糖>40%、NaCl>0.5 M的样品，然而由于这些样品中的病毒浓度也很高(>200 ug/ml)，因此可通过稀释过程来避免这种附加效应。季节性流感疫苗应当富有三种不同的流感病毒株(H1N1、A/H3H2和B)的每种各15 ug的血细胞凝集素。为了用SRID方法来分析三价季节性流感疫苗半成品和最终产品，疫苗制造商必须进行三次单独的分析。有了生物传感器方法，就能够在单个实验中定量疫苗中的三种不同毒株(图7)，让三价疫苗的批次放行更加有效。此外，与SRID相比，生物传感器方法显示出更高的回收率和测量精确度。精确度更高，将有可能减免过高疫苗剂量的需要。

综上所述，本文展示的初期数据表明，与SRID相比，生物传感器方法具有高准确性及更高的灵敏度和精确度，同时可显著减少的分析和手工操作时间。将这种方法扩展到固定化亚基、裂解甚至整个病毒疫苗的形式，将会开创定量方法的更广泛应用，包括表位定位和动力学分析等基础研究。