3.2.5.1 简并密码子

使用简并密码子，可在希望改变的位点上编码若干氨基酸的混合密码。同样，在仔细选择要随机化的对应位点引入简并密码子，不仅可以引入期望的碱基，而且可以引人期望的氨基酸。如已经讨论过的，盘绕螺旋在不同位置对氨基酸类型有偏好。例如，e 和 g 残基常是极性且互补的（表 3. 4)，因而，Glu-Lys 相互作用可以替换 Glu-Arg 相互作用，对分子结构只有极少扰动（因为 Lys 和 Arg 在体积与电荷上相当相似）。在这种情况下，Arg 可以引进，而 Lys 可以保留在库中，以观察从分子整体上看，哪个氨基酸更适合。同样地，疏水核心在a 位偏好 β 分支氨基酸，这意味着，虽然在野生型中可以期待找到 Val，lie 也许更合适。但是，必须注意到，执着于这些偏好则是过分简单的，表面上不利的残基对设计非特异结构和甚至整体稳定结构是必需的（见参考文献 [8])。但是，一般来说，保持整体的“两元样式”将能够保证得到所有的库中成员，有合理的机会形成盘绕螺旋结构，而不是能量上有利的其他结构。盘绕螺旋库成员将像野生型结构所做的那样，掩埋它们的疏水残基，并用极性的 e 和 g 残基将这些疏水残基包围起来。对一个盘绕螺旋来说，疏水核心的维持，称为 “ 3-4重复”（a 到 d 和 d 到 a 分别是 3 和 4 个残基间隔）是基本的。最后，可能合成特异的三核苷酸聚合物，使得到的基因序列编码，并只编码期望的最终氨基酸序列 [79] 。这也有助于在容许更多期望的待筛选的变化的同时，保持低库容。对使用正规的简并寡核苷酸的简并密码子，情况不是这样的。依赖于密码子用法表，可能意味着为了有两个期望的氨基酸，另一个不期望的氨基酸必须包含在那个位置（见 3.2.5.2 和图 3.2 )。也有可能，在密码子表相反两 端的两个氨基酸是期望的，但是在现实中，只能用这样预先合成的三核苷酸密码子才能包括进来。这样的三核苷酸建筑模块近来已商品化（Glen  Reserch，Sterling,  VA；Metkinen Oy，Finland)。



3.2.5.2 密码子偏向

密码子偏向是指一种而不是另外一种密码子将编码一个特定的氨基酸（图 3.2A )。例如，在大肠杆菌中，CGT 编码 Arg 的次数比 CGA 多 5 倍。很明显，当用包含编码库中多肽的基因的质粒转染细胞（如大肠杆菌）时，必须选用在宿主有机体中常用的三联体，而不是不常用的密码子，后者可能导致可读框移位 [ 80~82] 或库中代表性不好的序列。还有，在设计用于筛选的库的情况。例如，希望引进 β-分支氨基酸的所有组合到 a 位，但这取决于密码子的用法。图 3.2. 显示某些我们最喜好的密码子组合，用于盘绕螺旋的不同位置。大多数组合只包括少数选项以使库维持在合理的大小。通过检查图 3.3 ( 大肠杆菌密码子用法；对此或其他有机体见 www.kazusa.or.jp /condon) 我们见到，如果要盘绕螺旋的 a 位包括 Val、lie 和 Thr，需要密码子 GTN、ATH ( 如果 Met 必须避免）和 ACN。这会意味着在密码子的第一位需要 G 或 A，第二位需要 T 或 C，并且第三位需 要除 G 以外的任何其他核苷酸，因为 ATG 会编码 Met，导致简并的密码子 RYH ( 所有作为结果的密码子都是大肠杆菌经常使用的）。但是，对于 Val、lie 和 Thr 的组合，不可能排除库中不需要的氨基酸，因为上述核苷酸的混合也会包括编码 Ala 的 GCH。



另一个例子是，如果想包括氨基酸 Gin、Asn 和 Lys，则根据默认的编码，必须也包括 His。但通过合成只编码那些需要的氨基酸的三联核苷酸，这个问题是可以克服的 [ 31，79] 。另外，必须仔细排出表示得不好的密码子。例如，在表示 Arg 时就会遇到这种情况，因为在大肠杆菌中短缺 AGG 和 AGA 密码子的氨酰基 tRNA 合成酶。最后必须注意，如果一个位点在库中需要无偏向的表示，那么在那个位点上对所有氨基酸都应该选用 1 : 1 的比例（与代表它们的密码子一样）。在一个简并位上，某一个氨基酸比另一个氨基酸更多地表达，会自然地把对应于此差异的偏向引人体系中，因为那个氨基酸得到了更多的表达。

3.2.5.3 筛选系统

向盘绕螺旋开放的最常用筛选系统是蛋白质片段互补测试选择。在这个测试中，相互作用的蛋白质，如两个盘绕螺旋片段，被系在报告蛋白的两边上，仅当两个融合蛋白或多肽结合的时候报告蛋白才被激活。这已被用于二氢叶酸还原酶、泛素 [89] 、β-半乳糖苷酶 [ 90 ]、β-内酰胺酶 [ 91，92 」和绿色荧光蛋白 [93] 这样的胞内测试，有同时抗蛋白酶敏感或抗毒性多肽选择的额外优点。

用于盘绕螺旋的另一个筛选系统是酵母双杂交系统。在这个系统中，一个螺旋被融合于 Gal4p 转录因子的结合结构域（它与一个启动子结合），而另一个螺旋则融合于其活性结构域（它与聚合酶相互作用）。只有两个螺旋间的相互作用能够把两个嵌合蛋白拉到互相接近的位置并允许转录激活子起作用，并因而激活可以测试活性的报告基因 ( 如 β-半乳糖苷酶 ) 。使用这一系统，可从一蛋白质库中筛选到一个蛋白质或结构域的新的相互作用伙伴（ 最新的述评，见参考文献 [94])。

λ 抑子系统，是基于通过用一杂寡聚化的结构域取代其 C 端结构域，使大肠杆菌 λ 阻抑子的活性重新恢复。当 C 端结构域与自身（同型相互作用）或来自另一个融合蛋白的不同的结构域（异型相互作用）形成二聚体（或更高的寡聚体）时，就探测到阻抑作用。或者通过模拟噬菌体感染免疫，或者通过检测对 β-半乳糖苷酶那样的报告子的阻抑，可以探测到功能阻抑子的存在 [ 95，96] 。

最后，通过噬菌体展示，蛋白质可以展示在丝状噬菌体的表面外壳蛋白上。从展示在噻菌体上的多肽库中可以挑选结合者通过几轮挑选来浓缩。这一技术也容许挑选与非天然化合物结合的蛋白质 [97]。

3.2.5.4 与设计有关的计算

某些研究组不使用体内选择系统，而是使用计算的方法得到盘绕螺旋的有希望的序列。本节讨论与此有关的问题。

 ( 1 ) Keating 等发展了一种计算方法，以预测疏水核心突变对相互作用特异性的效应 [98]。通过使用一种算法，综合范德华堆积作用能，溶剂化效应和 a 螺旋倾向性，来达到此目的。据此，可预测来自于核心堆积的伴随偏好。设计了核心 a 和 d 残基突变为 Leu、lie 和 Val 的盘绕螺旋，以产生 6 个不同稳定性的不同的杂二聚体（见注 32)。该算法可以预测稳定性，并与实验数据很符合。

( 2 ) Mayo 的小组使用设计的算法估算表面蛋白相互作用。他们检测了 3 个打分函数：氢键位能，与没有补偿的极性氢掩埋罚分相结合的氢键位能，氢键位能与螺旋倾向结合 [69] 。对这 3 个打分函数中的每一个，以 GCN4 - pl 为例（见注 2 )，用该算法找到优化的氨基酸序列，并合成相应的多肽。得到的所有多肽都是二聚的；在 1°C ，近 100% 是螺旋的；较之于具有随机分布的表面亲水残基的 GCN4 多肽的 15°C，熔融温度为 69~72°C。数据建议，在盘绕螺旋多肽表面残基的序列设计中，螺旋倾向性是关键因素。

( 3 ) 为了要生成具有右手超螺旋缠绕的盘绕螺旋，发展出了一种算法，即加入了对主链游变性的处理 [99] 。因为要用固定主链的话，一个已经存在的例子便可提供坐标定位，即使这样，这些数值对近同源调整后的序列可能并不适合。通过骨架的游变性，可从一小组主链构象中取样。这些取样然后再与侧链堆积取样相耦合。结果，以计算方法设计出了右手二聚的、三聚的以及四聚的盘绕螺旋（见注 33 )。疏水极性残基构成的样式规定蛋白质的整体折叠。寡聚态、主链构象以及侧链旋转异构通过计算，在不同的主链结构中找到最好的堆积来选择。得到的多肽正确地形成与设计目标一致的寡聚态，四聚体 X 射线结构与设计的结构在原子细节上相符。

( 4 ) Harbury 的一篇文章结合了正向（期望的结构）和负向（远离不期望的其他结构）设计，以优化相互作用的特异性 [ 见3.2.2.2 ( 3 ) ; 参考文献 [39]]。 GCN4 中心七元重复的 a 位、d 位、e 位和 g 位改变为所有非脯氨酸残基，以产生大约 8 X 10⁹ 个可能的序列（见注 15)。该算法类似于计算的双突变循环，其中的多肽是序列优化的， 而不是结构优化的。考虑过的能量竞争态有： 

a. 折叠齐二聚期望结构；

b. 能量上有利的杂二聚体；

c. 未折叠的能量不稳态；

d. 难溶聚集态。

对于候选序列，这 4 种竞争态中的每一种都计算了自由能。这种所谓的“多态”设计比单态设计体系有一个优点，后者只寻找目标的最低自由能。不像这些设计，多态设计的结构常常偏离 PV 假定，并且同时，考虑到一些因素，如引起聚集的过多的疏水暴露和降低稳定性的过多的极性掩埋。更适当地，这种设计考虑了所有这些因素，当这些竞争的力支配对目标态的选择时，这种设计才需要改变。因而，选择是稳定性和特异性间平衡的结果，而不仅仅是目标稳定性。