试剂、试剂盒 鸡胗2-巯基乙醇缓冲液 H(10X)

仪器、耗材 聚丙烯烧杯匀浆器聚碳酸酯离心管超速离心机带刻度的聚丙烯量筒粗棉布聚丙烯漏斗

实验步骤

材料与设备

鸡胗（25 个；保存于-20°C)(如，Pel-Freez,Inc.)

2-巯基乙醇（2-ME; 分子量 78.13Da; 密度 1.114)

聚丙烯烧杯（4000-ml)

匀浆器（如，BrinkmarmPolytron)

聚碳酸酯离心管（6x500-ml)

超速离心机，备有 3000-ml 体积的转头

带刻度的聚丙烯量筒（4000-ml)

粗棉布

聚丙烯漏斗（大的，宽嘴型)

试剂

缓冲液 H(10X)

(配方，见“试剂的配制”PP.82~83)

操作程序

1) 取鸡胗，室温下解冻 2 h, 然后 4°C 过夜。

2) 用手术刀除去每个胗的两叶之间的白色结缔组织，但不必担心主叶周围的少量结缔组织。弃去结缔组织，将胗切成约 1cm3 的小块。

3) 称量清理好的胗组织块，并记录重量。

4) 用蒸馏水稀释 10x 缓冲液 H 储液 f 配制成 2L1x 缓冲液 H, 每 L 加 70.1ul 2-ME, 使终浓度为 1 mmol/L 2-ME。

5) 将胗组织置 4000-ml 聚丙烯烧杯中，加人 2 倍体积（即，2 ml/g) 的1x 缓冲液 H。例如，若有 400 g 组织，则加 800 ml 缓冲液。于冷室中，将缓冲液中的组织转移至匀浆器，以接近最髙的速度匀浆三次，每次 30s。

6) 将匀浆倒入 500-ml 聚碳酸酯离心管中，用巴氏吸管平衡（匀浆相当粘稠，故需折去巴氏吸管的尖端使吸管口变大些）。于髙速离心机中，4°C，8000r/min 离心 30 min

7) 将上清倒人置有两层粗棉布的聚丙烯漏斗中，滤至带刻度的聚丙烯量筒。让上清沿量筒侧壁注人，使提取物不致产生大量泡沫（如倒啤酒不让起酒沫那样）。用刮勺将沉淀物取出，合并，放回聚丙烯烧杯。加 1 倍体积的 1X 缓冲液 H〔以原材料的原始湿重为基础（见上文第 3 步〕。重复匀浆并离心。

8) 合并第一、二次所得的上清，记录总体积。留取 0.1%(约 1 ml) 体积的上清供随后的活性测定用。你将需要知道这两个体积以作计算