酶联免疫分析技术在食品检验中的应用
摘 要：目的：以大米为例研究分析酶联免疫分析技术在食品检验中的应用。方法：选取适量的大米检验混合样本，称量样品重量并在样品中加入适量的甲醇溶液，充分摇匀，过滤出提取物，同时加入适量的蒸馏水进行稀释，利用酶联免疫分析术进行检验，观察检验结果。结果：应用酶联免疫分析技术可有效测试出大米中所含有的黄曲霉毒素B1（AFTB1）等。结论：从本文的研究结果可以看出，酶联免疫分析技术在实际的食品检验中具有重要的应用价值，值得进行广泛推广。
黄曲霉毒素属于一种产毒菌株的代谢物，这种代谢物并不属于单一的化合物，从另一个角度来说，其在结构上与化合物有着某种相似性，但是与化合物之间还是有着明显的不同。这种物质是引发癌症的主要物质之一，其所具有的毒素为肝脏毒素，如果被人体所吸收，就会对人的健康造成严重的影响。由于其所具有的毒性以及危害性较大，所以，对其进行严密的检测就显得尤为必要。而这种毒素可能会存在于大米等食物中，利用酶联免疫分析技术来对其进行检测，可有效的降低检测的误差值，使得检测的结果更加的精确，下面就对这种检测方法在测定大米中AFTB1的实际应用效果进行深入的研究分析。
1.实验部分
1.1仪器和设备
小型粉碎机；内径为0.995mm的分样筛；分析天平；滤纸；微量移液器及配套吸头；培养箱；黄曲霉测定仪；酶联免疫测试盒。
1.2酶联免疫测试盒组成
① 包被抗体的聚苯乙烯微量反应板24孔。② A试剂：稀释液，甲醇：蒸馏水为7：93（V/V）。③B试剂：AFTB1标准物质溶液，1.00 。④C试剂：酶标AFTB1抗原（AFTB1---辣根过氧化物酶交联物，AFTB1-HRP）；AFTB1：HRP（摩尔比）<2：1。⑤D试剂：酶标AFTB1抗原稀释液，含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PH7.5磷酸盐缓冲液的配制：称取3.01克磷酸氢二钠，0.25克磷酸二氢钠，8.76克氯化钠加水溶解至1升。⑥ E试剂：洗涤母液，含0.05%吐温-20的PBS溶液。⑦F试剂：底物液a，四甲基联苯胺（TMB），用PH5.0乙酸钠----柠檬酸缓冲液配成浓度0.2克/升。PH5.0乙酸钠---柠檬酸缓冲液的配制：称取15.09克乙酸钠，1.56克柠檬酸加水溶解至1升。⑧G试剂：底物液b，1毫升PH5.0乙酸钠---柠檬酸缓冲液中加入0.3%过氧化氢溶液28微升。⑨ H试剂：终止液，C=2摩尔/升的硫酸溶液。
1.3试验试剂的配制
1.3.1选取两种试剂，并标注为C、D。在C试剂中，适当的进入一些D试剂，试剂的容量在1.5ml范围内，充分摇匀，制成酶标AFTB1抗原溶液，用作试验试剂，留存于冰箱中冷藏保存。
1.3.2E试剂中加入300毫升蒸馏水配成实验用洗涤液。
1.3.3甲醇水溶液：甲醇：水为5：5（V/V）
1.4样品的处理
分别称取5.0克样品于4个100毫升具塞三角瓶中，准确加入25.0毫升甲醇水溶液，于3～4号三角瓶中加入1ug/ml的标准溶液50微升，振摇15分钟，过滤，弃去1/4初滤液，收集式样滤液。分别取样液0.5毫升与4个10毫升比色管中加入1.5毫升A试剂将样品提取液进行稀释，摇匀。此液为样品待测液。
1.5实验步骤
1.5.1试剂平衡：将测试盒于室温放置15分钟以上，平衡至室温。
1.5.2小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设定1号孔为仪器调零孔，2～7号孔为AFTB1标准对照孔.8～11号孔为样品孔。
1.5. 3 洗涤：每孔加入250微升洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1分钟后甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。
1.5.4依次加入配制好的溶液及待测样液。
第一步：1号孔加入50微升A试剂，2～7号孔分别加入系列的B试剂（AFTB1标准容液：0，0.1，0.25，0.5，1.0，2.0ng/ml）50微升，其余各孔加入相应的待测样液50微升。
第二步：1号孔加入50微升D试剂（酶标抗原稀释液）其余各孔均加入50微升C试剂（酶标抗原稀释液）。
第三步：轻轻的振摇，使各孔的反应物混匀。
1.5.5反应：将反应板放入37度恒温培养箱中孵育30分钟。
1.5.6显色，每孔分别加入F试剂（显色底物液a）和G试剂（显色底物液b）各50微升，摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15分钟。
1.5.7终止与仪器测定：每孔分别加入H试剂50微升，用酶标测定仪在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。如下表：
2.结果
2.1计算公式
AFTB1含量（ng/g）=C×V/M×D
式中，C：待测样液中AFTB1含量（ng/ml）
V：样品提取液体积（ml）
M：样品质量（g）
D：样品稀释倍数
2.2含量计算
查数据，经反对数计算可知 C8=C9=0ng/ml C10= 0.436ng/ml C11= 0.458ng/ml
10号样品中AFTB1含量（ng/g）=0.436× 25/5×4=8.72
11号样品中AFTB1含量（ng/g）=0.458×25/5×4 = 9.16
平均值 =（8.72+9.16）/2=8.96（ng/g）
2.3回收率计算
⑴加入AFTB1量 1ug/ml×50ul=50ng
⑵回收率=（8.96×5-0）/50 ×100% =89.6% 3、讨论
由试验结果可知，在对AFTB1进行测定的过程中，应用酶联免疫分析技术可以有效的减少相应的检验步骤，使得检验步骤更加的简便，同时也能够提高检验的精确性，而且由于该技术自身所具有的高灵敏度以及特异性，使得其检验的误差相对较小，在实际的食品检验中，其是一种值得被广泛推广的检验技术。
在目前的免疫检测方法中，酶联免疫分析法应用较为普遍，这种方法在实际的应用中，主要是利用抗原抗体反应所具有的特性与酶对底物所产生的催化作用所结合，从而进行物质的检测。显示的结果主要是通过酶作用后底物所出现的颜色变化来辨别。一般来说，这种检测方法主要是应用酶标测定仪来进行检测结果的测定，其具有较强的敏感度分析能力，其敏感度最佳可以达到ng水平，随着酶联免疫分析技术的发展，其应用的领域逐渐拓展，在目前的食品检测中，酶联免疫分析技术的应用越来越广泛，在食品的其他检测领域中，酶联免疫分析技术也有着一定的应用作用。
例如，在检测食品的农药残留中，很多的国际权威机构都已经认识到了酶联免疫分析技术的应用优势，并将其应用在食品中农药残留的检验中，并且将其作为主要的检验方法来应用，甚至在很多的西方发达国家中，还在此检验技术的基础上，研制出了新型的商品检验试剂盒，并将其应用到食品农药残留的检验中。而酶联免疫分析技术主要能够检测出食品中所含有的除草剂、杀菌剂以及杀虫剂等农药的残余。再例如，在检测食品中的微生物方面，在过往的微生物检验中，主要依靠的是手工操作，不仅会使得检验的时间过程，也会使得检验的精确度下降，而采用酶联免疫分析技术这种方法对食品中所含有的微生物进行检验，酶联免疫分析技术所具有的敏感性以及特异性会高达97%以上，甚至达到了100%。除此之外，这种检验方法不会受到来自食品提取样品中存在的各种成分的干扰，检验的结果具有较高的准确性，并且这种检验方法可以有效的缩短检验的时间，最短2天就可以得出检验结果。
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