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大肠杆菌转化实验——CaCl2转化法

2019.3.25


实验方法原理	细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA，然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
实验材料	大肠杆菌
试剂、试剂盒	CaCl2 氨苄青霉素 LB
仪器、耗材	离心机分光光度计摇床
实验步骤	1. 接种一个单菌落于50 ml LB培养液中，于37℃摇床培养过夜（250 r/min）。 2. 往一个2 L 的烧瓶中加入400 ml LB培养液，再加入4 ml 过夜培养液，于37℃；摇床，培养至OD₅₉₀为0.375。 3. 将培养液分装到8个50 ml 预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 离心7 min。 4. 细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl₂溶液重悬，于4℃，以1 100 g 离心5 min 。 5. 细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl₂溶液重悬，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 离心5 min。 6. 用2 ml 冰冷的CaCl₂溶液重悬各管细胞，然后按每管250 ul 的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中，立即冻存于- 70℃。 7. 按照以下各步骤用10 ng pBR322转化100 ul 感受态细菌。 8. 将合适体积的转化物涂于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。 9. 将10 ng 加入到一个15 ml 无菌的圆底试管中，并放置冰上。 10. 将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。 11. 立即将100 ul 感受态细菌加入到管中，轻轻旋动，并放置冰上10 min 。 12. 将管故入42℃水浴2 min 进行热休克，然后加入1 ml LB 培养液于每一支试管中。 13. 于37℃置滚筒式摇床口培养1 h。 14. 将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上，于37℃培养12~16 h。收起
注意事项	1.转化菌涂平板前抗生素的量要足够，涂布细菌时菌量不要太多，培养时间不要超过16小时。否则抗生素会失效，未转化菌也会生长。 2.制备感受态细胞的过程中，每一步操作的动作要轻柔，尤其是悬浮细胞时要避免用旋祸混合器。 3.所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。