过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
实验概要
植物在逆境下或衰老时,由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸,蛋白质等生物大分子,并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此,植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验利用紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
实验原理
H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
主要试剂
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮);
0.1mol/L H2O2(用0.1mol/L高锰酸钾标定)。
主要设备
紫外分光光度计;离心机;研钵;250ml容量瓶1个;0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支;10ml试管3支;恒温水浴;
实验材料
受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
实验步骤
1.酶液提取:
称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2~3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.测定:
取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表1顺序加入试剂。
表1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号 | S1 | S2 | S3 |
粗酶液(ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
pH7.8磷酸(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
蒸馏水(ml) | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性。
3.结果计算: 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= (ΔA240*VT)/(0.1*V1*t*FW) 式中 ΔA240 = AS0-(AS1-AS2)/2 AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值; AS1, AS2—样品管吸光值; Vt—粗酶提取液总体积(ml); V1—测定用粗酶液体积(ml); FW—样品鲜重(g); 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u); t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
注意事项
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。