细胞凋亡检测：形态学特征的检测方法
根据调亡形态学特征的检测方法
一、普通光学显微镜观察方法
1 ）苏木素－伊红染色（ HE 染色法）
1． 取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋， 4 μ m 切片。
2． 切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（ I ） 5min →二甲苯（Ⅱ） 5min → 100％乙醇 2min → 95 ％的乙醇 1min → 80 ％乙醇 1min → 75 ％乙醇 1min →蒸馏水洗 2min 。
3． 苏木素染色 5min ，自来水冲洗。
4． 盐酸乙醇分化 30s （提插数下）。
5． 自来水浸泡 15min 或温水（约 50 ℃） 5min 。
6． 置伊红液 2min 。
7． 常规脱水，透明，封片： 95 ％乙醇（ I ） min → 95 ％乙醇（Ⅱ） 1min → 100 ％乙醇（ I ）1min → 100 ％乙醇（Ⅱ） 1min →二甲苯石碳酸（ 3 ： 1 ） 1min →二甲苯（ I ） 1min →二甲苯（Ⅱ） 1min →中性树脂封固。
2 ）甲基绿－派诺宁染色法
1． 新鲜取材组织固定液中 4 ℃固定 3 ～ 6 小时。
2． 直接转入 95 ％乙醇脱水和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
3． 切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水。
4． 置染色液中室温下染片约 1h 。
5． 取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。
6． 插入丙酮中迅速分化。
7． 转入丙酮二甲苯（ 1 ： 1 ）稍洗。
8． 二甲苯透明 2 ～ 3 次。
9． 中性树胶封固。
3 ） Giemsa 染色
1． 收集细胞（ 1 × 106 ）， PBS 洗 1 次。
2． 用细胞涂片离心机制成细胞涂片。
3． 甲醇固定 3 ～ 5min 。
4． 入 Giemsa 稀释染色液 15 ～ 30min ，冬天在 37 ℃温箱中染色。
5． 用磷酸盐缓冲液分色，以镜下控制为准。
6． 涂片晾干后用中性树胶封片。
4 ）瑞氏（ Wright ）染色
1． 收集细胞（ 1 × 106 ）， PBS 洗 1 次。
2． 用细胞涂片离心机制成细胞涂片。
3． 甲醇固定 3 ～ 5min 。
4． 用 Wright 液染色 2min 。
5． 入 Wright 磷酸缓冲液稀释液 4 ～ 10min ，然后用蒸馏水冲洗。此时如果颜色较深，可 0.08 ％醋酸分化数秒钟。
6． 直立晾干后，用中性树胶封固。
二、透射电子显微镜观察方法
1 ）透射电镜样本的取材和固定
培养细胞的取材和固定
1． 常规收集帖壁和悬浮细胞，置离心管中离心， 800 ～ 1000r/min ， 10min 。
2． 用 0.01mol/L PBS 5ml 重悬细胞。
3． 将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。
4． 离心， 2000r/min ， 15 ～ 20min ，使细胞成团。
5． 小心吸去上清，加入 2.5 ％戊二醛固定液固定细胞团，以免细胞团散开。
6． 取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。
7． 将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中， 4 ℃（可长期）保存。
8． 用 0.1mol/L PBS 缓冲液洗 1 次。
9． 1 ％锇酸后固定 30 ～ 60min 。
三、荧光显微镜观察方法
1 ）吖啶橙染色法
1． 制备活细胞悬液，浓度约为 107 /ml 。
2． 取 95 μ l 的细胞悬液，加 5 μ l 的吖啶橙贮存液混匀。
3． 吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。
4． 荧光显微镜选用激发滤片 BG 12 或 BV 等，阻断滤片用 515nm 或 SP3 。
2 ） Hoechst33258 染色法
1． 原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。
2． 细胞固定液 4 ℃固定 5min 。
3． 蒸馏水稍洗后，点加 Hoechst33258 染色液， 10min 。
4． 蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。
5． 封片剂封片后荧光显微镜观察。
3 ） Hoechst33342 染色法
1． 将 Hoechst33342 加入培养的细胞中，终浓度为 10 μ g/ml 37 ℃孵育 30min 。
2． 4 ％的多聚甲醛和培养液以 1 ： 3 混合，使多聚甲醛的浓度为 1 ％，固定细胞 5 ～ 10min 。
3． 固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。
4． 荧光显微镜激发滤片选用 UV 激发滤片，阻断滤片为 400 ～ 500nm 。
以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：
1． 收集（ 0.5 ～ 3.0 ）× 106 个细胞， 500 ～ 1000r/min ，离心 5min 去上清。
2． PBS 洗 1 次， 500 ～ 1000r/min ，离心 5min 去 PBS 。
3． 用 3 ％多聚甲醛 50 μ l 重悬细胞，室温下固定 10min 。
4． PBS 洗 1 次， 500 ～ 1000r/min 离心 5min 去 PBS 。
5． 用 15 μ l 的 Hoechst33258 或 33342 重悬细胞，终浓度为 16 μ g/ml ，孵育 15min 。
6． 取 10 μ l 放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数 500 个细胞，计算调亡率。
