细胞分离纯化技术
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
| 实验方法原理 | 常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，水性高，平均分子量为400000，当密度为1.2 g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 |
|---|---|
| 实验材料 | 淋巴细胞分离液 血清 肝素 |
| 试剂、试剂盒 | 肝素 Hank's液 PBS |
| 仪器、耗材 | 滴管 吸管 针头 碘酒 酒精 棉球 止血带 计数板 显微镜 离心机 |
| 实验步骤 |
1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
4个大方格内细胞总数 单个核细胞浓度（细胞数/1 毫升细胞悬液）＝────────×104×2（稀释倍数） 4
活细胞数 活细胞百分率＝────── ×100 ％ 总细胞数 用本法分离PBMC，纯度在90 ％以上，收获率可达80～90 ％，活细胞百分率在90 ％以上。
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| 注意事项 |
1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
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| 其他 |
一、附录 ─────────────────────────────────────── PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 ─────────────────────────────────────── A液（ml） 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5 B液（ml） 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5 ─────────────────────────────────────── A液28 毫升，B液72 毫升，加蒸馏水100 ml
（1）RPMI-1640培养液 RPMT-1640（FLOW公司出品）1 袋，三蒸水1000 毫升，电磁搅拌30 分钟：1N HCl 调PH7.2～7.4（约加2.5 毫升），过滤除菌，作无菌试验，4 ℃保存。 RPMI-1640 95 毫升，0.1M丙酮酸钠 1 毫升，0.2 M谷氨酰胺 1 毫升，1 M Hepes 1 毫升，7.5 ％ NaHCO3 1 毫升，青霉素、链霉素（各1万单位）1 毫升 不完全1640培养液90 毫升，灭活胎牛（或新生牛）血清10 毫升
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