基于液滴的纳升体积的微细管蛋白结晶系统（MP...（二）

3.1 MPCS实验

使用MPCS microbatch-style结晶实验形成液滴，这里蛋白质和结晶试剂融合并且使用油（氟化合物FC40; Li et al., 2006; Yadav et al., 2005)包被培养。MPCS有两种类型的结晶筛选：fine-gradient screening 和 hybrid screening。

3.3.1 Fine-gradient/optimization screening

MPCS梯度模式允许检晶仪非常精细扫描结晶相空间。因为在MPCS实验中水流的控制是使用MPCS泵系统和MicroPlugger软件单独控制的，而且，通过改变单独通道的流量，很容易形成一系列液滴的浓度梯度（图1c; Zheng et al., 2003)。尽管沉淀剂流量的减少，缓冲液流量的增加，但总的流量保持不变(虽然MicroPlugger软件允许用户设计一个定制的实验来适应他们的需求,包括改变形状或总和的水流动速率)。使用Fine-gradient，一个特殊的蛋白质-沉淀剂结合的结晶相空间可以仔细用于结晶优化或绘制出从微晶体到单晶的过渡（图3）。同样的方法，所谓的反向筛选可以使用两种结晶混合物促进结晶体的形成（Stura et al., 1994）。芯片的浓度梯度可以使用沉淀剂、配合体、protein partners或保护剂。为减少用于结晶优化的蛋白质体积，Fine-gradient可以减少蛋白需要，当需要形成不同的蛋白质晶体复合物或DNA突变时是必需的。

图3：应用Fine-gradient形成的磷酸核糖焦磷酸激酶结晶相图。从沉淀剂（左下）到微晶沉淀剂（右下）到微晶体（左中）到少量结晶体（右上）到单晶（左上）沉淀剂梯度表现出平稳的过渡。

3.1.2 hybrid screening

hybrid screening结合芯片形式的稀疏矩阵筛选梯度（Li et al., 2006）。稀疏矩阵筛选是不同结晶剂组成的液滴要通过形成一个‘pre-formed cartridge’实现（Zheng & Ismagilov, 2005)。在MPCS hybrid screenin方法中，pre-formed cartridge包括一系列~100nL的液滴进入3+1 mixer的一个。使用Microplugger软件的Hybrid模型，pre-formed cartridge中每一个结晶试剂的浓度梯度通过改变预先形成的液滴和缓冲液的流量。在相同的实验中进行稀疏矩阵和梯度筛选时允许MPCS扫描大块结晶相空间，每一个预先形成的结晶体液滴的不同浓度可以20-40个单独的结晶。

4.产生用于衍射的结晶体

MPCS是一个低体积蛋白结晶筛选工具：他可以产生用于衍射的结晶体。虽然实验体积（10-20nL；准确的体积依赖于CrystalCard和流量）远远小于传统的结晶技术。但是，10-20nL液滴包含足够的蛋白用于结晶，已经足够获得有用的X射线衍射数据。液滴中结晶沿着最长的轴生长40–200 µm（通道的尺寸为200×200µm）。因为结晶体用于衍射实验，关键是要有方法获取衍射数据，并且不需要增加实验或阻碍另一个实验技术。MPCS提供两种方法用于获得X射线衍射数据：传统的冷冻结晶提取和原位衍射。

4.1从MPCS CrystalCard取出蛋白结晶

蛋白质结晶体可以直接从MPCS CrystalCard上单独的液滴提取。一个薄的塑料层粘合与塑料板上，包含微流电路。这一薄层有一个粘合剂，这种设计可以防止在结晶实验中液体从CrystalCard流出，缺点是需要手工剥去（图4a和4b）。此外,液滴保留在塑料部分包含了微电路。薄的塑料层被剥离后，结晶体露了出来，而且理想的结晶体可以通过微小的工具如cryoloops收获（图4c和4d）。两种技术可以用于移除冷冻保护的结晶体：（1）结晶体可以和cryoloop仪器取出放置在理想的冷冻保护剂中或者（2）可以吸取大约1微升冷冻保护剂在包含结晶体的液滴的顶部，这样当结晶体取出时他已经沉淀在冷冻保护剂中。使用第一种技术，通过碳氟油层可以使液滴的蒸发延迟5min。使用第二种技术，液滴的蒸发延迟至少20分钟，可样可以有充裕的时间来提取许多结晶。

图4:从MPCS CrystalCard上提取用于衍射的结晶体。（a）从MPCS CrystalCard剥离的薄的塑料覆盖层图片。（b）打开的CrystalCard，所有的结晶保存与塑料板上包含微液流电路。使用cryoloop从CrystalCard上取出结晶体。（d）在cryoloop中的结晶体。

结晶提取使用MPCS fine-gradient screening产生蛋氨酸-R-亚砜还原酶结晶体（图5a）。结晶体形成的梯度筛选的浓度优化为30%(v/v) MPD，25%(w/v) PEG 1500, 0.1 M醋酸盐（pH4.5）。蛋白浓度为22 mg ml-1（20 mM HEPES pH 7.0,500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM DTT）。结晶体的提取使用0.1-0.2mm的cryoloop，低温冷冻（使用crystallant作为冷冻保护剂）且用于X射线衍射实验。一个1.7 A ˚数据集在beamline SBC-CAT 19BM上获取（阿贡国家实验室的APS（Advanced Photon Source）,随后得到了其结构（图5b和5c，表1）。最后的调整和结构因素都提交于蛋白数据库中（PDB code 3cxk)。

图5：蛋氨酸-R-亚砜还原酶。（a）蛋氨酸-R-亚砜还原酶结晶体图。（b）半胱氨酸残基和锌离子（3ό）F0-FC OMIT轮廓图。（c）Burkholderia pseudomallei中得到的蛋氨酸-R-亚砜还原酶NCS二聚体的连续剖面图。黄球体代表锌离子，球状和棒状体代表醋酸盐离子。结构提交于PDB（3cxk）。