检测肝癌细胞基因表达的实验方法！

　　检测肝癌细胞基因表达的实验方法！

　　材料与方法

　　⒈材料

　　人肝癌细胞系HepG2由中国医科大学科学实验中心保存。DMEM培养基和胎牛血清购自BioInd公司。细胞转染试剂Lipofectamine 3000和Trizol购自Invitrogen公司。BDNF AS质粒、BDNF AS与BDNF基因完全互补序列缺失突变质粒以及空载体质粒购自上海和元生物公司。无内毒素质粒中提试剂盒购自天根生化科技公司。Goscript TM Reverse Transcription System反转录试剂盒和GoTaq ® qPCR Master Mix试剂盒购自Promega公司。BDNF AS和BDNF引物购自Origene公司。BDNF兔抗人一抗和GAPDH引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。β-actin小鼠抗人一抗和羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术公司。BCA蛋白质含量检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司。

　　Alexa Fluor ® 594驴抗兔荧光二抗购自Thermo Fisher Scientific公司。Quantikine ® ELISA Human BDNF Immunoassay试剂盒购自R&D Systems公司。FISH试剂盒以及Cy5标记的lncRNA BDNF AS探针和Cy3标记的BDNF mRNA探针由Creative Bioarray公司设计并合成, 其中, BDNF AS探针既能检测内源也能检测外源转入的lncRNA BDNF AS。

　　⒉实验方法

　　⑴细胞培养和转染

　　肝癌细胞HepG2使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基, 37 °C、5% CO2条件培养。采用细胞转染试剂Lipofectamin 3000转染, 将BDNF AS质粒、BDNF AS与BDNF基因完全互补序列缺失突变质粒以及空载体质粒分别瞬时转染HepG2细胞, 转染过程按试剂说明书进行, 简述如下。转染前24 h给细胞传代, 保证转染时细胞达到90%融合。用Opti-MEM稀释Lipofectamine 3000, 同时, 用Opti-MEM稀释质粒DNA后加入P3000混匀。

　　将稀释好的DNA和Lipofectamin 3000混合, 室温孵育5 min后加入细胞, 继续培养48 h用于下述实验。细胞实验至少重复3次。

　　⑵qPCR方法检测lncRNA BDNF AS和BDNF mRNA水平

　　Trizol提取细胞总RNA, 紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度, 取5 μg总RNA反转录成cDNA。qPCR应用Roche LightCycler 480 Real-time PCR扩增仪完成, 按照试剂盒提供的操作说明书进行。BDNFAS引物序列分别为F: 5′-TAC CAC AAG GTA CCA

　　ACC ATA TAT G-3′, R: 5′-CAT GTG GTT CTG TTT CAA TGC CC-3′, PCR产物长度135 bp。BDNF引物序列分别为F: 5′-CAT CCG AGG ACA AGG TGG CTT G-3′, R: 5′-GCC GAA CTT TCT GGT CCT CATC-3′, PCR产物长度161 bp。反应条件为: 95℃预变性2 min； 95℃扩增15 s, 60℃退火1 min, 共40个循环。以GAPDH作为内参, 采用2 –ΔΔCt 方法进行数据分析。

　　⑶ Western blot方法检测BDNF蛋白质水平

　　细胞加入RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂, 置于冰上裂解。4℃条件下离心, 取上清, 按BCA试剂盒说明测定蛋白质浓度。取80 μg总蛋白, 采用12%SDS-PAGE分离, 并转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h后, 分别用兔抗人BDNF和小鼠抗人β-actin(1)002 4抗-4℃孵育过夜, 然后用山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(1 2育孵温室)000 2发LCE ,h׃光成像。采用Image Pro-plus 6.0软件测定每个蛋白条带的积分光密度值, 计算同一个样品BDNF和β-actin积分光密度之间的比值, 作为BDNF的相对表达量。

　　⑷ELISA方法检测培养上清中BDNF蛋白质水平

　　离心收集细胞上清液用于检测BDNF蛋白质水平。ELISA实验操作按照试剂盒说明进行, 简述如下。50 μL待测样品或标准品用100 μL检测稀释液稀释后, 加到孔板中室温孵育2 h, 加入100 μLBDNF偶联抗体室温孵育1 h, 加入200 μL底物溶液显色。多功能酶标仪校正波长设定570 nm, 于450 nm波长处读取吸光度值。

　　⑸免疫荧光染色观察BDNF蛋白质水平

　　PBS漂洗细胞, 用4%多聚甲醛室温固定, 5% BSA封闭后,向细胞中滴加兔抗人BDNF一抗(1抗驴及)释稀002׃兔荧光二抗(Alexa Fluor 594), DAPI复染细胞核, 荧光显微镜观察并采集图像, 采用Image Pro-plus 6.0软件测定细胞的平均光密度值。

　　⑹FISH方法检测lncRNA BDNF AS和BDNF mRNA水平和定位

　　FISH实验操作按照试剂盒说明进行, 简述如下。分别用0.2 mol/L HCl和0.3%Triton X-100室温孵育细胞, 4%多聚甲醛室温固定细胞后, 向细胞中滴加RNA杂交缓冲液, 55℃预杂交2 h。将RNA探针(探针用杂交缓冲液1)释稀002׃于85℃变性5 min, 37℃保持2 min。向细胞中滴加探针, 橡胶胶水封片, 在37℃湿盒中避光杂交过夜。

　　DAPI复染细胞核, 激光扫描共聚焦显微镜(FV1000,Olympus)采集图像, 采用Image Pro-plus 6.0软件测定细胞的平均光密度值。

　　⒊统计学分析

　　实验采用SPSS 13.0软件处理数据。One-WayANOVA分析用于比较不同处理组细胞之间的差异,组内两两比较采用LSD-t检验。结果用均值±标准差表示, P<0.05为差异有统计学意义。

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