大肠杆菌中非天然氨基酸的整体掺入实验

实验材料 大肠杆菌菌株色氨酸类似物寡核苷酸引物

试剂、试剂盒 结合缓冲液清洗缓冲液洗脱缓冲液

仪器、耗材 Luria-Bartani 培养基Microcon 浓缩器

实验步骤

下述方法包括：

( 1 ) 大肠杆菌在色氨酸类似物中的生长。

( 2 ) 含 fW 取代氨基酸的蛋白质的表达和纯化。

( 3 ) 对非天然氨基酸进行深入水平的分析。

3.1 大肠杆菌在非天然氨基酸（培养基）上的生长

色氨酸类似物掺入大肠杆菌是直截了当的。因为色氨酰转移 RNA 合成酶没有编辑结构域，天然氨基酸与类似物的区分只是在结构上。枯草杆菌色氨酰转移 RNA 合成酶可以相对更有效地结合（装载）荧光化的色氨酸类似物；4 fW 的结合比 W 低 6 倍，而 5fW 的结合比 W 低 74 倍 [ 13 ]。与此类似，已经知道色氨酸类似物进入细胞，并在类似物的毒性起作用之前支持最少几代的生长。为了使色氨酸类似物有效掺入，使用带有防止生物合成的突变细菌菌株（见注 2；参考文献 [ 4~6 ]，[ 9 ] 和 [ 11 ])。在本节介绍的例子中，使用了大肠杆菌菌株 C600 及其衍生菌株。基本培养基中补充了苏氨酸、亮氨酸、硫胺以及色氨酸类似物，或某些比例的非天然对天然氨基酸。习惯上，培养基是用补充成分命名的。例如，M9B1TL 95% 4 fW + Ap 补充了维生素 B1 ( 硫胺）、苏氨酸、亮氨酸、19：1 的 4fW : W 和 Ap。

非天然氨基酸掺入对细菌生长能力的影响可通过分析生长曲线来确定。ELX808 微板阅读器 [ 14 ] 或 Bioscreen  C [5] 这样的仪器可以并行地获得多条微板格式的生长曲线。在用 Bioscreen C 的测试中，C600p 在基本培养基中的过夜培养液稀释 100 倍后，接种到每种 1.5 ml 的测试培养基中，以测试对生长的抑制。将这些 1.5 ml 的培养基按 350 μl 分到 3 个小坑中。于 37°C 不停地摇动，直到所有培养物均进入稳定生长期。把生长曲线的指数部分拟合到方程：

式中，f 为时间；N 为时刻 t 的菌体数（或光密度）；N0 是初始的菌体数，可以算出菌体固有的生长速率 r。例如，在生长曲线的指数部分拟合到式（2.1 ) 以后，在对 W 的比率在 97% 以下时，4fW 很少引起生长速率的改变，而 5fW 和 6fW 的影响要激烈得多（图 2.1)。因此，作为细菌的常规生长，比率 19 : 1.4 fW : W 可以在培养基中使用。如果培养基只提供 4fW 的话，大肠杆菌可以连续几代生长。而且，通过拟合整条曲线（与仅拟合指数期相反）到对数生长方程，可以达到对生长曲线的更完全理解。这个对数生长方程考虑了承载能力：

式中，除了培养物的承载能力 K 以外，其他变量与式（2.1 ) 相同。这个方程已用于在氨酰化错误条件下大肠杆菌氨基酸类似物掺入效果的定量化 [15] 。

3.2 掺入 4fW 的蛋白质的表达和纯化

本节描述建立两个表达质粒（见 3.2.1.1 和 3.2.1.2 ) 以及在 W 替换为 4fW 的高置换率条件下蛋白质表达和纯化的步骤（见 3.2.2.1 和 3.2.2.2 )。用表达和纯化的语言，在氨基酸类似物上的生长所需要的工艺变动，与只在天然氨基酸上的生长略有关系。最后，这一节将对从已掺入非天然氨基酸的细菌中分离胞内总蛋白的方法给一个 概述。

3.2.1 表达载体的构建

1 ) pGSR

由于 C600p 中的 pUC18 质粒 pGEX-KG  [ —种谷胱甘肽-S-转移酶（GST )表达载体] 需要 Ap 以外的选择方法，因而，用 SmaI 和 EcoRI 降解质粒。P182Sfi-Kan 的 Kn 激酶基因由引物 Kan 1.39  ( 5'-CGCGGATCCGGCCACCATGGCCAAGCGAACCGGAAT) 和 Kan2.39 ( 5 LCCGGAATTCTGAGGCCTGACAGGCCTTAGAAGAACTCGT  ) 用 PCR 扩增。PCR 产物用 BsaBI 和 EcoRI 降解并连接到 Smal 和 EcoRI 降解后的质粒 pGEX-KG 上 [16]，然后转化到 DH5F' 中，再用微量制备分离（ QIAgen) 。得到的质粒 pGSR 是一种带有 Kn 抗性的 GST 表达载体。

2) pET100GFPuv

高荧光的 GFPnv 的基因从质粒 pGFPuv 用 Vent DNA 聚合酶（NEB) 以引物 CFPA (5，-CACCACGGCCACTGTGGCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-3’）和 CFPB ( 5 ,- GGCCATCGGGGCCCTATTTTATAGTTCATCCATGCC-3' ) 通过 PCR 扩增；拓扑异构酶介导的定向克隆需要在正向引物中的 5'-CACC 片段。通过 7.5 μl PCR 产物与 1 μl 的 10X 缓冲液、1 μl 的 4 mmol dNTP 和 0.5 μl 的 Tag DNA 聚合酶在 72°C 保育 20 min，把突出的腺苷残基加在扩增产物上。按制造者的指示，这个反应用来克隆 GFPuv 基因到 pET100/D-topo 中。拓扑异构酶反应是用来转化化学上具竞争性的 TOP10 细胞。得到的质粒用微制备（QIAgen) 分离。PET100GFPuv 带有 Ap 抗性并且在 T7 核酸（RNA ) 聚合酶启动子的控制下，需要在携带 λDE3 溶源体的寄主菌株中表达 GFPuv。

3.2.2 蛋白质表达和纯化

为了实现非天然氨基酸的高水平掺入，初期的生长是在比较宽松的条件下进行的，然后转变到包含诱导子的更具限制性的条件下 [5] 。这一目的也可以通过提供有限数量的容许氨基酸和过量的非天然氨基酸来实现。当天然氨基酸耗尽时，这些非天然氨基酸就会得到利用（见注 3 和参考文献 [17 ])。

1）高掺入 4fW 的 GST 的表达和纯化

( 1 ) 在 M9B1TL 95% 4 fW + Kn 中，过夜生长的用 pGSR 转化的并在 Kn 板上选择的 C600p 的一单菌斑。

( 2 ) 把第一步的初始培养稀释 100 倍接种于 100 ml 同样基质的培养液中。把细菌培养到中指数期（mid - log ) ( 在 600 nm 处，光密度 0.5 )。

( 3 ) 以 5400 g 离心培养液 20 min，并悬浮在补充了 0.3 mmol/L IPTG 的 100 ml M9B1TL 3 X 100% 4fW + Kn   中，继续培养 16 h ( 见注 4) 。

( 4 ) 如步骤 3 将细胞离心，再用 5 ml B-PER ( Novagen ) 试剂裂解。

( 5 ) 离心去除不溶解部分之后，加入 10 mmol/L 氯化镁（ 从 1 mol 储备液中取）和 5U DNA 酶，常温保育 15 min。

( 6 ) 加入 500 μl 50% 谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠浆到裂解液中，并在常温下用搅拌机混合 2 min [18] 。

( 7 ) 以最高速度简单离心球珠。加入 5 ml PBS 冲洗球珠。再重复冲洗 2 次。

( 8 ) 用 1 ml 冰冷的 PBS 做最后的冲洗，再移到微离心管中。

( 9 ) 在室温下用 50 mmol/L Tris-氯化氢，pH 8.0，外加 5 mmol/L 还原的谷胱甘肽。在室温下旋转 2 min 以从球珠上洗脱纯化的 GST，分 3 次进行，每次 0.5 ml。

( 10 ) 用 M icrocon 浓缩器浓缩这 3 份样品。

( 11 ) 用 SDS-PAGE 测定蛋白质纯度；纯度应高于 95%。

2 ) 掺入 6fW 的 GFPuv 的表达和纯化

( 1 ) 在 200 ml 的 M9B1TL W + Kn + Ap 中生长的 C600F ( DE3 ) 中加入 pET100GFPuv。

( 2 ) 在中指数期，离心培养并使得到的细胞小团重新悬浮在 100 ml 含 1 mmol/L IPTG 的 M9B1TL 95% 6 fW + Kn + Ap 中再继续生长 3 h ( 见注 4 ) 。

( 3 ) 在终止培养并用 3 ml B-PER 裂解细胞小团。以 15000 g 离心 30 min 以清除不溶物。在上清液中加入 10  mmol/L 氯化镁（从 1 mol 储备液中取）并加入 3U DNA 酶，在室温保育 10 min。

( 4 ) 准备 3 ml Ni-NTA 柱，用 15 ml 水和 9 ml 结合缓冲液冲洗。

( 5 ) 让上清液通过 Ni-NTA 柱。用 30 ml 结合缓冲液和 18 ml 冲洗缓冲液冲洗，再用 18 ml 洗脱缓冲液洗脱。从柱上逐份搜集洗脱液，每份 0.5 ml，用 SDS-PAGE 和用紫外光照射分析（含有蛋白质的样品可见荧光）。浓缩含蛋白质的样品如 2.3. 2.2 中 1 ) 所述。

3.2.3 细胞全蛋白抽提物的纯化

用于 4fW 的掺入：

( 1 ) 在 25 ml 恰当的基质中生长 C600p 到饱和；

( 2 ) 离心培养液其变为液滴，并在 200 μl B-PER 中裂解；

( 3 ) 让 50 μl 裂解液通过 Centri-Sep 尺寸排斥柱以去掉未掺入的氨基酸。

类似地，用于分析细菌对 6fW 的鉴别：

( 1 ) 在 100 μl M9B1TL W + Kn 培养基或 M9B1TL 95% 6fW + Kn 培养基中，使生长的 C600F 达到饱和；

( 2 ) 使细菌聚集成颗粒状并在 200 μl B-PER 中裂解；

( 3 ) 半体积的裂解液通过 Centri-Sep 柱 [ 见 2.3.3.1 中 1) ] 。

3.3 非天然氨基酸掺入程度分析

本节讨论了确定非天然氨基酸掺入水平的两种方法。完全水解然后用 HPLC 和质谱分析 [ 见 2.3.3.1 中 1 ) ] ，或 者 HPLC 分析之后在不同的条件下再用 HPLC 分析 [ 见 2. 3. 3.1 中 2 ) ] ，可以用来纯化蛋白质和全细胞蛋白抽提。但是，蛋白质酶解和片段分析（见 2.3.3.2 ) 只 能用来纯化蛋白质。

3.3.1 纯化蛋白的分析

表 2.1 列举了应用 2.3.3.1 中 1 ) 和 2.3.3.1 中 2 ) 两个小节所述方法的例子。

1 ) 含非天然氨基酸蛋白的水解和 HPLC-ESI 分析

蛋白质样品的酸水解可以确定蛋白质的成分。不管是全细胞蛋白抽提物或纯化的蛋白质，都要经过整体平均化。

( 1 ) 冻干蛋白样品（如 2.3.2.3 中从 Centri-Sep 柱出来的半量洗脱液，2.3. 2.2 中几毫克纯化蛋白）。

( 2 ) 将团体物质重悬在 1 ml 含 10% 巯基乙酸的 5.4 mol/L 氯化氢中以在水解中保护色氨酸。

( 3 ) 在真空和 110°C 下水解过夜。

( 4 ) 冻干水解产物，并重悬在 50 μl 的水中。

水解产物可用 HPLC-ESI 分析。在这种情况下，当从 HPLC 柱上洗脱时，天然的和非天然的氨基酸的比质量可被测定和跟踪。洗脱质量的相对比率可用曲线下的面积确定。氨基酸的实际摩尔数可用标准曲线确定。

2 ) 水解蛋白样品的 HPLC-HPLC 分析

另一种办法是完成一系列的 HPLC 分析。

( 1 ) 把水解试剂注入 C-18 柱并用下列步骤洗脱。

a. 用 94% 缓冲液 A 和 6% 缓冲液 B 洗脱 20 min。

b. 10 min 内用梯度法切换到 98% 缓冲液 A 和 2% 缓冲液 B。

c. 再洗脱 15 min。 

d. 在最后 5 min 将柱子重新平衡到 94% 缓冲液 A 和 6% 缓冲液 B。

( 2 ) 收集对应于标准峰（如 W 和 6fW ) 的洗脱液并冻干，再重悬在水中。

( 3 ) 把样品重新注入同一个柱中，但缓冲液改为 80% 缓冲液 C 和 20% 缓冲液 D。不同分子的同时洗脱可能发生在一组缓冲液条件下，但不大可能发生在两组缓冲液的条件下。在第二个缓冲条件下的曲线下面积可以认为是纯样品，并可以比较对应于天然的和非天然的峰面积。

在有色氨酸和色氨酸类似物的情形下，280 nm 处探测，不需要衍生化（见注 5)。苯丙氨酸和酪氨酸在纯化的蛋白质中显示小的吸收峰，而全细胞蛋白的抽提物会产生大量的小峰。尽管如此，定量的数据仍可得到。

3.3.2 蛋白酶降解以确定非天然氨基酸掺入水平

由于特定多肽片段的质量可以基于蛋白质序列预测，预测片段的质量位移有可能是由于特定非天然氨基酸掺入的结果。因而，分析蛋白酶降解产物就是确定氨基酸类似物掺入的敏感方法 [ 5，19，20] 。

( 1 ) 冻干纯化的 GST [ 如 5 μg，见 2.3.2.2 中 1 ) ] 并重悬在 0.1 mol/L 乙碳酸氢铵中。

( 2 ) 在 37°C 用被固定化的 L-甲苯磺酰胺-2- 苯乙基氯甲基酮处理过的胰蛋白酶 (Pierce) 降解 10 h。

( 3 ) 离心以去除胰蛋白酶（见注 6 )。

( 4 ) 冻干降解物，并在水中重悬至 210 μmol/L。

( 5 ) 用 HPLC-ESI 分析降解产物。

可以跟踪特定质量的洗脱剖面，并证明非天然氨基酸在特定片段中的掺入水平（图 2.2 )。