脂筏的分离和应用（二）
附 加 材 料
在 S D S 中的溶解
3a 用 100ul 沉淀物裂解液重悬 Triton X -IOO的裂解沉淀。使混合物通过带22 G 针头的I m l 注 射 器（以剪切D N A ) 至均一。用 I m l 包 含 1 % Triton X -100的 冰 冷 T N E / P缓冲液进行稀释， 4°C ，最大速度离心 2 min，保留上清，弃去剩余的不溶性物质。
4a. 为 了 进 行 2 个组分的比较，用 2 0 % 的 S D S 储 存 液 将 初 始 的 Triton X -100 上清液(步骤 2 ) 调整至终浓度 0.1% S D S 。用 免 疫 共 沉 淀（单 元 12. 2)、 S D S - P A G E (单
元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹（单 元 12. 5 ) 对等量的 2 个组分进行分析。
在 辛 基 葡 糖 苷 中 的 溶 解
3b. 用 I m l 含 有 60 mmo l /L 辛 基 葡 糖苷的冰冷的 T N E /P 缓 冲 液 于 冰 上 重 悬 Triton X -100 裂解沉淀 20 min，以便溶解 D R M 蛋白。涡旋混勻， 4°C ，最高速 度 离 心 2 min，保留上清液并弃去沉淀。
4b 通过免疫沉淀（单 元 12. 2)、 S D S - P A G E (单元 12. 3 ) 和 免 疫 印 迹（单 元 12. 5 ) 等方法，对等量的该组分及原始的 Triton X -100 裂 解 上 清（步 骤 2 ) 进行分析。
辅 助 方 案 1 脉冲追踪方法分析去污剂抗性的膜蛋白
附 加 材 料
辅 助 方 案 2 通过放射性标记检测去污剂抗性的膜蛋白的全部组分
附 加 材 料
P B S ，无菌
无甲硫氨酸、包含透析血清的培养基（透析血清方法见附录 1 ; 用量取决于细胞类型）
[35S] 甲硫氨酸
1 . 在 I O c m 组织培养皿里接种贴壁细胞。如果有必要，将待测细胞接种于两个培养皿里 ，但是只对其中一个培养皿进行标记（对于非贴壁细胞，接 种 5 X 1 0 6 个细胞，离
辅 助 方 案 3 定 量 高 效 薄 层 色 谱 法（HP-TLC) 进 行 DRM 脂质分析
材 料
甲醇
氯仿
I : 1 和 2 : I (V /V ) 氯仿/ 甲醇
溶 剂 A : 30 : 60 : 8 (V /V A O 氯仿/甲醇/水
硅 焼 化 试 剂（Sigmacote， Sigma)
D E A E 葡 聚 糖 凝 胶（Sephadex) 混 悬 物（见辅助方案 4)
溶 剂 B : 30 : 60 : 8 (V 7V7 V ) 氯仿/甲醇/0• 8mol/L 乙酸钠
8 : 4 : 3 氯仿/甲醇/0. lmol/L 氯化钠
0.lmol/L 氯化钠
溶 剂 C : 3 : 48 : 47 (W V /V ) 氯仿/ 甲醇/0.lmol/L 氯化钠
溶 剂 D : 3 : 48 : 47 (V /V /V ) 氯仿/ 甲醇/水
氮气
反 相 C 1 8 柱（见辅助方案 5)
中性脂质标准品
酸性脂质标准品
乙酸
甲酸
己烷
异丙醚
脂类显影试剂
S W 2 8 转 子 和 超 速 离 心 管（Beckman)
带 Teflon 内衬盖子的 15m l 玻璃管
大 功 率（Laboratory Supplies，型 号 G S P 1T ) 或标准浴槽超声破碎仪
24m m Whatman G F /C 玻璃纤维滤器
过滤设备：玻璃微量分析过滤装置（Fisher) ，或以 橡 胶 垫 圈 插 入 125m l 侧臂烧瓶的 24m m Buchner 漏斗
带磨口玻璃瓶颈的 125m l 平底烧瓶和管子
旋转蒸发器
玻璃棉
一 次 性 IO m l 宽口玻璃移液管
玻璃棒
IO m l 硅烷化移液管
5m l 带 T e f lo n 内衬盖子的锥形玻璃管
带单孔瓶塞的 125m l 侧臂烧瓶
无荧光指示剂的 1 0 c m X 2 0 c m 髙 效 薄 层 色 谱（H P -T L C ) 板（Merck)
带玻璃盖的薄层色谱缸
预 热 至 l〇〇°C 、 110°C 、 180°C 的烤箱
改 良 的 IOjL d H a m ilton 注射器：带有斜切边缘的注射器，可将上样角度减少一半，有利于少量滴剂的上样
带磨口玻璃塞的 IOOm l 刻度量筒
剪成色谱缸大小的吸水纸
有冷却装置的吹风机
0.5 〜I c m 厚错块
光密度计
注 ：所有接触 D E A E 葡聚糖凝胶的玻璃制品使用前均要硅烷化处理。玻璃棉装好后 ，把玻璃棉和柱子一同进行硅烷化处理。
1 . 准 备 1 0 瓶 I O c m 培养皿贴壁细胞的裂解产物（见基本方案，步 骤 Ia〜4a) 或 者 2 XIO8 个的非贴壁细胞的裂解产物（见基本方案，步 骤 Ic〜4c)。
2 . 利用蔗糖梯度浮选法制备 D R M (见基本方案，步 骤 5〜7)。从交界面处获取并离心收 集 D R M (见基本方案，步 骤 8b〜IOb) ，使 用 S W 2 8 而不用 S W 4 1 转子并且按比例增加体积。
3.D R M 沉 淀 中 加 入 I m l 甲醇，剧 烈 振 荡 至 沉 淀 悬 起 ，移 入 带 有 T e f l o n 内衬盖子的1 5 m l 玻璃管中。用 I m l 甲 醇 洗 2 次 ，将每一次的洗液合并入原管。再 加 入 3m l 氯
仿 ，随后加入 6 ml 1 : 1 (W V ) 甲醇和氯仿混合物。
4 . 应用高强度浴槽型超声破碎仪（推荐使用）或者标准超声破碎仪处理几秒。室温振荡孵育过夜。在真空中用 24m m Whatman G F /C 玻璃纤维滤器过滤到 125m l 侧臂烧瓶中。
5 . 用 IOml I : I (V7 V ) 甲醇和氯仿溶液冲洗过滤器。将溶液倒入一个适用于旋转蒸发器的带磨口玻璃瓶颈的 125m l 平底烧瓶中，用旋转蒸发器干燥。置 5m l 溶剂 A 中溶解脂质。
6 . 用玻璃棒将一小卷玻璃棉塞到一个 IO m l 宽口玻璃移液管的尖端。把柱子装在环状支架连接或者用夹子夹住。将 2 m l 硅烷化试剂注入移液管和玻璃棉。 5m l 甲醇冲洗并且确保玻璃棉没有沾在移液管内侧壁上。
7 . 用一只 IOm l 硅烷化移液管，向柱内加入足够量的 D E A E 葡聚糖凝胶以形成一个 2m l 柱床。用 10 倍柱体积的溶剂 A 填塞柱子。用巴氏移液管将溶解的脂质上柱。用 10 倍柱体
16.用 I : I (V /V ) 氯仿/甲醇溶解脂质。调整每个样品的浓度，预计上样量为 5〜20ul(每种脂质含量在 1〜7/xg) 。 试验几种浓度以确保有一种浓度在标准曲线范围内。
17.用改良的 10M1 Hamilton 注射器上第一个样品，在起始线的两个点之间点入一系列扩 散 至 5m m 宽的极小液滴。使溶剂短暂干燥后接着在前一样品上点入更小的液滴，持续点样直至所需的上样量。
1 8 . 将剩余样品上样，并选取合适的中性或酸性脂类对照，上 样 5 ul (含 1 〜 7ug脂质），将平板室温干燥 5m in 。 临用前在带磨口玻璃塞的 IOOm l 量 筒 中 配 制 70. 8m l 溶 剂 I :4 2 m l 氯仿、 1 8m l 甲醇、 7 . 2 m l 乙酸、 2 . 4 m l 甲酸和 1 . 2m l 蒸镏水。
19.在 T L C 缸中加入溶剂和吸水纸，使吸水纸饱和，立 即 以 玻 片 盖 住 并 以 重 物（如两个装满液体的 4L 水罐）压住防止挥发。将 点 有 样 品 的 T L C 平 板 放 于 T L C 缸 中 ，使起始位置处在缸底部，立即盖上并压上重物。
20.溶剂前沿泳动至距离平板底部 6 cm (到达事先用铅笔标记的位置）时 ，从缸中取出平板，风 干 15〜30 min。如果有必要也可用电吹风的冷风吹干。溶剂挥发期间可同时在带磨口玻璃塞的IOOml 量筒中配制 102m l 的溶剂体系 II: 65m l 己烧、 35m l 异丙 醚 和 2m l 乙酸。
21.在另一个 T L C 缸中加入溶剂和吸水纸，使吸水纸饱和，立即盖住防止挥发。当第一溶剂挥发后，将点有样品的T L C 平板放于 T L C 缸中。泳动至溶剂前沿到达平板顶 部（10c m )。从缸中取出平板，风 干 15〜30 min。将用过的溶剂丢弃，吸水纸彻底风干留作再次使用（可重复使用若干次）。
22.将平板浸于脂类显影试剂中，或者在通风橱中将该液体喷于板上，使其湿透。将其竖起流干液体至板的光泽淡去。
23.将平板置于预热 100°C 的烤箱中烘干 1 〜2m in ， 待其颜色改变之前取出，然后放置于另一 1 8 0 °C 烘箱中的 0. 5〜I . O cm 厚铝块上干燥 5〜lO m in ， 至颜色充分显现但尚未出现背景颜色时取出，冷却待用，如 需 要 保 存（可 达 24 h) ，则 应 以 旧 的 T L C 平
板（其上硅胶均已去除）覆盖，用塑料膜包裹住，保存于一 20°C 。
2 4 . 在 24 h 内以密度仪扫描色带，利用中性或酸性脂质标准品绘制标准曲线，将样品与适当的标准曲线进行比对测定。
