磷酸交联AFFI-GEL 10 亲和介质实验——肽链交联

寡聚肽链（合成的）Affi-Gel 10

二甲基亚砜（DMSO）N-甲基吗啉乙醇胺乙醇胺·HClPBS／叠氮化物高盐／高 pH 溶液高盐／低 pH 溶液NaClNaSCN

聚丙烯离心管（带螺口盖）旋转混合仪IEC临床离心机真空吸液器玻璃层析柱

1. 用 0. 5～4 倍柱床体积的 DMSO 溶解肽。

2. 如下滴定中和肽溶液：每次滴加 1～2 μl 肽合成级的 N-甲基吗啉（原液或以 1:1 至 1:9 稀释于 DMSO 中），然后取出 2～3 μl 稀释于50 μl 水中，滴加到 pH 试纸上。

重复上述操作直至 pH 为 7～8。

滴定要仔细，因为很容易超过所需的 pH 范围。一般每 3 μmol 肽需要用 7～8 μl N-甲基吗啉滴定，具体的量主要取决于特定的氨基酸序列。取出的等份必须与水混合再测 pH，因为 pH 是测量氢离子的浓度，因此非水溶液无法测量 pH。

3. 将装有 Affi-Gel 10 介质的瓶子摇荡混合以使树脂充分悬浮，取需要量的树脂到带螺口盖的聚丙烯离心管，用 DMSO 洗3次，每次于室温以 700 g 离心 5 min ,吸去上清，重悬于5倍体积的 DMSO 中，然后再次 700 g 离心。

4 . 从树脂上吸取多余的 DMSO，加入步骤 2 配制的肽溶液。室温下旋转混合孵育过夜。

5. 每毫升树脂加入2 μl 乙醇胺，室温下旋转混合孵育 2 h。

6. 按步骤 3 的方法用 DMSO 洗 2 次。

7. 按步骤 3 的方法用 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl，pH 8.0 洗 2 次（第一次洗涤在冰上操作，因为会产生大量的热量)。第二次洗漆后，吸去洗涤液，换上新鲜的 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl 并于 4℃ 旋转混合孵育过夜。然后低速离心，吸去上清。

8. 按步骤 3 的方法用高盐/高 pH 溶液洗 3 次。

9. 按步骤 3 的方法用高盐/低 pH 溶液洗 3 次。

10. 按步骤 3 的方法用 PBS/叠氮化物溶液洗3次，然后将洗过的树脂储存在 4℃ 以备装填柱子。

11. 用 0.5 mol/L NaCl 将介质制成悬浮液，倒入玻璃层析柱。

12. 依次用 10 倍柱体积的 3 mol/L NaSCN 和 10 倍柱体积的 PBS/叠氮化物溶液洗柱。

确保至少吸取所需体积两倍量的Affi-Gel 10，因为体积会缩减。所买的树脂一般是50% 的悬浮液，因此必需取所需柱床体积 4 倍的量。不要以高过推荐的速度离心，因为这样会损坏树脂。