qRT-PCR
实验概要
实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前，实时定量PCR所使用的荧光化学组分一般可分为两种：荧光探针和荧光染料。
1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变，如单核苷酸多态性（Single
Nucleotide Polymorphisms，SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
本部分将以SYBR荧光染料为例介绍qRT-PCR的操作方法。
主要试剂
SYBR Green、H2O、特异引物
主要设备
200 μL八联管
实验步骤
①根据干细胞特异基因的mRNA设计引物，并送交引物合成公司合成。②提取RNA：使用TRIzol®试剂，参照厂商产品说明书。
③cDNA合成（Reverse Transcription, RT）：市场上有很多商业化试剂盒，参照厂商产品说明书。
④确定上机内容，在记录本上编排好上机的样品排放顺序。
注意：实验中，一个样品的加样尽可能安排在同一行。另外，正式实验中三次重复不能安排在同一板上，需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板。
⑤配制qPCR反应体系：
| 成分 | 单份剂量 | 终浓度 |
| 2×SYBR® Green Realtime PCR Master Mix | 7.5 mL | 1× |
| 引物混合物 (10 mM) | 0.6mL | 0.4 mM |
| cDNA模板 | X mL | 不超过总反应体系的10%；可做系列稀释来确定优化用量。 |
| H2O | 加至15 mL |
⑥循环（根据不同的扩增片段和引物调整循环的条件）：95℃ 2 min；95℃ 10 s, 55℃ 15 s, 72℃ 10 s, 循环40次；95℃ 1 min, 60℃ 30 s, 95℃ 30 s。
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