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常用的分子生物学基本技术(三)

2019.5.03

DNA序列分析(DNA sequencing) 应用各种突变检测技术检测到的基因突变,最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置,其效率可以达到100%。现在的测序方法已与经典的方法有了很大的不同,其基本原理虽仍是双脱氧终止法,但自动化程度大为提高,操作更简便,测序时间也大大缩短。随着PCR技术与测序联合使用,不需经过M13亚克隆步骤,故称为直接测序法(direct sequencing,DS)。DS法测序的模板主主要来源于PCR,应用不对称PCR(asymmetric PCR)和基因组扩增转录同步测序法(genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS)等,使单链产物大大增加。近年来,PCR循环测序法的建立,使模板扩增与同步进行,引物用四种不同前颜色的荧光标记,使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行,大大提高了测邓的自动化程度。目前PE公司推同出的DNA自动测序仪已发展到96泳道,并仍在不断改进。这些高度自动化的测序方法是经较理想的基因突变分析技术,但其昂贵的费用其使用范围,所以对一些小样本或为了某些特定目的的样本分析,仍进行经典的手工测序。

突变基因的检测方法多种多样,特别是PCR技术诞生后,许多检测技术都是在PCR基础上衍生的。由于PCR扩增南非要的模板量少,使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞,如霍奇金病的R-S细胞的单细胞基因突变分析。另外,应用显微解剖法(microdissection)可在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点,其优点是可克服肿瘤组只中间质或癌周组织的混杂,提高准确性。除上述介绍的方法外,还有多种方法也用于基因突变的分子检测,如对未知突变基因进行分析的酶促切割错配法(enzyme mismatc cleavage,EMC)、切割片段长度多态性(cleavage fragment length polymor phism,CEFLP)、双脱氧指纹图谱法(dideoxy finger printing,ddF)、错配接合蛋白质截短测试法(protein truncation test,PTT)等。对已知突变基因进行分析 的有引物延伸法(primer extension,PEX)、寡核苷酸链接检测法(oligonucleotide ligation assay,OLA)、毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)等方法。

用毛细管电泳技术检测DNA点突变
作者 樊兴君 金由辛
(中国科学院上海生物化学研究所、分子生物学国家重点实验室,上海 200031)


  毛细管电泳(CE)是90年代初发展起来的新技术,具有分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速和易于实现自动化的特点。后来又发展了激光诱导荧光检测器(LIF),大大提高了分析灵敏度,对微量样品如单细胞分析等,具有很大的优势。
  通常,利用CE技术可以在20min内分析完成几千个碱基的DNA片段。CE可以应用于DNA点突变的检测,目前在PCR基础上利用CE技术对DNA已知点突变及未知点突变的检测发展十分迅速。

1. 已知点突变的检测

1.1 扩增抗拒突变系统PCR(ARMS-PCR)和短串联重复PCR(STR-PCR)  ARMS-PCR和STR-PCR在检测已知点突变中愈来愈受到重视,尤其是用来诊断特殊遗传疾病和癌症。两种分析方法都包括利用可以辨别单碱基突变(ARMS-PCR)或者具有简单序列的不同数量的重复片段(STR-PCR)的引物进行专一性基因片段PCR扩增。CGE和ESCE都可以分析在ARMS-PCR基因PCR扩增中的单碱基取代产物。选择合适的多组PCR引物对可以同时对多个突变位点进行分析,Donohoe等[1]利用多重ARMS-PCR扩增反应鉴定了阿朴脂蛋白E基因。对于杂合子样品,STR-PCR 有一定困难,这包括长等位基因低的扩增效率和PCR扩增受阻(如非转一性片段的扩增),这两种情况都会引起低的扩增条带。传统凝胶电泳需要放射性标记来进行分析。利用ESCE方法,LIF检测器,在10min内对这种类型的PCR扩增产物4个碱基差别的DNA片段做到基线分离,体现了CE在这方面分析中的出色优势。高灵敏度的LIF和高分离度的CE可以提供一个取代传统凝胶电泳的一个有效工具。
1.2 连接酶链式反应(LCR)  LCR是一种点突变检测反应接着进行信号扩增的技术。在基因突变诱发人体疾病的程序性分析中十分有用。LCR反应中采用了两对互补寡核苷酸引物,如果引物的序列与目标序列能完全配对时,那么两对引物将与各自目标片段杂交,并连接;如果点突变出现在目标片段上时,将不能进行连接反应,就不会出现连接产物。Grossman等[2]利用ESCE快速分析了用于诊断膀胱纤维变性疾病的LCR产物,该方法也诊断了leber's遗传性光纤神经疾病。利用CE分析的时间大约是传统凝胶电泳的十分之一。用灵敏的LIF检测器可以做微量LCR分析,同样可以应用于分析那些紫外光可损DNA的分析。
1.3 等位基因特异性扩增分析(ASA)  ASA是一种点突变的检测方法,两种寡核苷酸引物被用在PCR反应中。如果引物的序列与目标等位基因序列完全配对,那么引物在目标片段上杂交并变成PCR扩增;如果点突变发生在目标片段上时,则无扩增产物出现。单道及多道的CGE已经用于快速提供ASA基因图谱的分析工作。Barta等[3]利用CGE及LIF检测器分析了多重ASA反应,对先天性肾上腺增生患者21-hydroxylase基因的多个突变位点进行检测。将多重PCR定量扩增同CE连接将提高分辨率和速度,优越于任何现在使用的手段。
1.4 限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)  PCR-RFLP是一种广泛用于检测已知DNA点突变的方法,它可以检测大到几千个碱基对DNA片段。该方法通过分析核酸限制性内切酶切割经目标模板PCR扩增的DNA片段上突变基因位点的有效性来分析DNA点突变。PCR-RFLP的分析可以利用CGE或ESCE,可以利用UV检测或LIF检测。ESCE被用在PCR-RFLP中检测病毒种系及分析通常在大量癌症病人和许多白血病衍生型病人中的K-ras locus DNA片段的基因突变位点[4],CE在分析过程中远优于传统的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2. 检测未知点突变

2.1 定量反转录PCR  在疾病状况下,特殊基因的突变活性影响病理的表现状态。定量反转录PCR(QRT-PCR)可以通过从mRNA合成的cDNA接着PCR定量扩增cDNA来估测基因的活性和表达。特征cDNA产物通常用凝胶电泳检测,定量方法或采用放射性同位素标记,或采用灰度扫描来完成。虽然自动DNA测序仪已被应用于QRT-PCR分析,但原位检测、峰面积定量和自动数据处理等CE技术可以提供直接RNA-PCR反应技术[5],而RNA-PCR反映了体内基因表达情况。重要的是,利用UV定量要比间接依靠扫描方法更为准确。
2.2 异源双链核酸分子多态性分析(HPA)  HPA广泛用于检测未知点突变。这种技术包括等位基因DNA片段变性(PCR-扩增)和接下来单链DNA分子重新退火形成一个原生型和突变型的双链DNA(dsDNA)片段混合物。这个组成是一个重聚的同源双链核酸分子(dsDNA)和新的异源双链核酸分子(dsDNA)的混合物。异源双链核酸分子出现的错配现象归因于结构的变化。在电泳过程中,异源双链核酸分子滞后于同源双链核酸分子。HPA依赖于DNA复制中局部结构的变化,随着DNA片段长度和围绕配对区域GC含量的增加,灵敏度会降低。
  HPA已被成功地用ESCE进行分析,这种方法可以从同源双链核酸分子片段中分辨出异源双链核酸分子片段,其仅有一个碱基对错配[6]。它可以用于快速检测DNA突变而不需要进行DNA测序。通常传统的分析方法受焦耳热效应影响,要想将片段完全分离,整个分析过程大约需要4个小时,而CE技术却可以在数分钟内完成。
2.3 单链构象多态性(SSCP)  SSCP也是一种分析未知点突变常用的方法。它包括双链DNA片段的解离,每两个单链片段依靠其特定序列组成一种折叠构象。SSCP分析的灵敏度依赖于是否突变影响到DNA的折叠和因此形成的单链DNA(ssDNA)分子在电泳中的移动速度。Atha等[7]利用ESCE结合SSCP分析了多组骨髓瘤患者P53肿瘤抑制基因372bpPCR产物的点突变。利用CE柱后多重荧光标记方法(一次分析检测多波长荧光),可以一次对多组突变位点进行准确分析。突变DNA具有相似的电泳迁移性,但不同的荧光探针可以以其不同的信号加以区分。即使利用先进的高效多道聚丙烯酰胺测序技术,分析也往往需要9个多小时,用CE技术则可以在11~25min内完成。多道CE分析可以将许多不同样品在同样短的时间内(<1h)完成分析,效率更高。
2.4 化学裂解错配分析(CMC)和酶裂解错配分析(EMC)  CMC和EMC都是检测未知点突变的比较新的方法。这两种方法都是提供主要的碱基错配区,PCR粗产物可以直接用这两种方法进行分析。通常,低吸收值的酶切产物需要放射性同位素标记PAGE分析,而CE则可以利用荧光标记的手段进行高灵敏度分析。Siles等[8]利用ESCE及LIF检测器对EMC反应的异热信号和PCR信号扩增两种方法产生DNA片段进行分析,以此来鉴定碱基错配位区。
2.5 变性梯度毛细管电泳(CDCE)  CDCE是一种在变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法上发展起来,对未知点突变进行分析的技术。被分析的dsDNA必须包括两个差异区(domain):一个50个碱基长度或G-C碱基对比例大的高熔温度区和一个包括异源双链核酸分子DNA错配对的低熔温度区域。在DGGE过程中,异源双链核酸分子进入包含一种或多种变性剂的梯度胶中,异源双链DNA分子链的裂解就会在错配位点开始并快速向低熔区扩张,这样就会极大地降低该分子在胶中的迁移速度。虽然DGGE对于突变点的检测率还不清楚,理论上可以达到100%。
  用固定浓度的变性剂(脲或甲酰胺)连同分离时可以升到的恒定温度,或在分离过程中采用微机控制温度不断升高的方法(温度程序),CDCE已经达到对一个错配碱基片段的分离。这些方法对于单碱基错配分析非常灵敏,但最直接的应用可能性决定于序列的组成,也就是说,是否有一个富含G-C区。很显然,一旦有一个G-C堆积(一个PCR引物的5′末端具有GC重复区)可以与PCR扩增产物或限制性片段相容,那么,出现的任何错配都可以容易地被CDCE检测。Cecilia等[9]利用ESCE技术检测了exon 17b(R10066H、R1066C、F1052V)基因片段上的三个点突变位点和exon 14a(v868v、t854t)上的两种形态;Muniappan等建立了利用温度程序对人体基因突变进行分析的方法。
2.6 双脱氧指纹分析(ddF)  ddF是一种结合SSCP和Sanger双脱氧测序法检测未知点突变的方法,理论上可以检测所有类型的未知点突变。在ddF方法中,Sanger测序反应完成与一个双脱氧终止子(terminator)的反应产物通过非变性凝胶电泳来分析,通过分析获得或失掉一个双脱氧终止片段(双脱氧组成的)和/或至少一种包含点突变的DNA片段(SSCP组成)的电泳移动性的转变来判断点突变。Felmlee等[10]利用非变性CGE技术,用ddF方法检测了M.Tuber-culosis特异性扩增DNA片段单个点突变,对于单个样品,CE可以在25min内完成。一个对比实验表明,单柱CGE分析30个样品用时15h,而用传统聚丙烯酰胺凝胶电泳则需要36h。
  CE是一个新发展起来的技术,它用于DNA点突变的检测是近年兴起的并迅速发展着的一个研究领域。它用于DNA点突变检测仍具有很大的潜力,如Khrapko及其合作者最近报道的用CE杂交技术检测DNA点突变,Piggee等报道的用单链寡核苷酸引物延伸及荧光标记方法检测DNA点突变等[11]。要详细了解CE检测DNA点突变技术,可以参考Le等的综述[12]。随着CE自身分析技术的不断改进和自动化程度的不断提高,如自动样品采集、制备、分析和数据处理,微柱快速分析的出现等,DNA点突变分析有望建立高准确度、高自动化的程序性分析方法。而程序性DNA点突变检测在临床诊断中具有十分重要的意义,也将会对生物化学及分子生物学等相关领域产生深远的影响。■


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