DNA的琼脂糖凝胶电泳实验
电泳法
| 实验方法原理 |
DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有的电荷效应和分子筛效应。 电荷效应是指DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电，在电场中向正极移动，且相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，能以相同速率移动。通常，DNA泳动速率随DNA片段长度的增加而减少，与电场强度成正比。 分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时收到较大阻力，依此分离不同大小的DNA片段。一般，DNA琼脂糖凝胶电泳可分离50bp到百万bp长度的DNA片段，视实际需求配制不同浓度和构型的琼脂糖凝胶。 |
|---|---|
| 实验材料 | DNA片段 |
| 试剂、试剂盒 | 琼脂糖 电泳缓冲液（1XTAE或0.5XTBE） 载样缓冲液 荧光插入染料（溴化乙锭或SYBR Gold） DNA大小标准品（DNA Marker） |
| 仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶电泳仪 紫外透射仪或紫外凝胶成像仪 微波炉 移液器 水浴锅 |
| 实验步骤 |
1. 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； pUC185祃+ddH2O3祃+溴酚蓝2祃共10祃于0.5 ml tube中混合后点样；
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| 注意事项 |
1. 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
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| 其他 |
常见问题原因分析 1. 跑出的DNA带模糊？ （1）DNA降解：避免核酸酶污染。 （2）电泳缓冲液不新鲜：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 （3）所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应<15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 （4）DNA上样量过多：减少凝胶中的DNA上样量。 （5）DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 （6）有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。 （7）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 2. 有不规则DNA带迁移？ （1）对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。 （2）电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；经常更换电泳缓冲液。 （3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 3. 跑出的DNA条带弱或无条带？ （1）DNA的上样量不够：增加DNA的上样量。 （2）DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。 （3）DNA走出凝胶：正确连接电极方向避免插反的情况，缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。 （4）所用光源不合适：对于用EB染色的DNA应用短波长（254nm）紫外光源。 4. 跑出的DNA带缺失不完整？ （1）如果是小DNA带，可能跑出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。 （2）分子大小相近的DNA带不易分辨，应延长电泳时间，并核准正确的凝胶浓度。 （3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
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