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腊肉香肠中苯并芘的检测

2020.3.04

【HPLC结合在线固相萃取对苯并芘进行测定】

本文利用双三元液相色谱仪，通过在线固相萃取建立腊肉香肠中苯并[a] 芘的检测方法，在现行国家标准基础上，进一步简化前处理方法、并确保分析过程更加灵敏、快速、准确。

苯并[a] 芘(英文缩写BaP)属多环芳烃类化合物，是一种常见的高活性间接致癌物质(结构式见图1)。

图1. 苯并[a] 芘化学结构图。

食物中的BaP 通常源自加工过程，当食材经高温处理时，所含的氨基酸和油脂类成分可通过裂解或热聚合生成BaP，若加工温度较高(如400 ~ 1000 ℃)，BaP 生成量将会急剧增加。由于腊肉、香肠等制品通常会经过烘烤或烟熏处理，生成BaP 的可能性相对较大，因此需要对其所含的BaP 加以严格控制。目前我国国标限定粮食和肉制品中Bap 的残留量应在5 μg/kg 以下，相应的国家标准及文献方法如表1 所示。

表1. 肉类产品中苯并[a] 芘的前处理方法

经比较发现，上述方法的前处理过程均较为繁琐，耗时较长，不便于大量样品的快速检测。本方法使用双三元高效液相色谱系统(DGLC-3600)，采用在线固相萃取(Online SPE)技术，首先将样品中难洗脱的动物油脂等成份保留在富集柱上(在线净化)，然后通过切换阀将易洗脱的目标物转入分析柱进行HPLC 分离，从而有效降低基质成份对目标物的干扰。该方法可实现样品自动化前处理，方法快速简便(测试周期约为30 min)，灵敏度高(检测

限按供试品取样量折算可达0.15 μg/kg)，且精密度和回收率好，适于大批次样品的快速检定;SPE 小柱可在分析过程中在线净化，重复使用，大大节省测试成本

材料与方法

仪器

高效液相色谱仪(Thermo Scientific Dionex Ultimate DGP 3600系列，包括有带在线脱气单元的双三元梯度泵，自动进样器，带有一个六通阀的柱温箱，荧光检测器，仪器连接参见图2。)

超纯水机(Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC，P/N：50131948)

台式离心机(Thermo Scientific Sorvall ST16，P/N：75004240)

旋转蒸发仪(Thermo Scientific RV10 V，P/N：IKA8022525)

匀浆机(Seward Stomacher 80，P/N：SWD0080/000/EU)

试剂和对照品

甲醇(色谱纯，Fisher Chemical，P/N: A452-4)

乙腈(色谱纯，Fisher Chemical，P/N: A998-4)

乙酸乙酯(色谱纯，Fisher Chemical，P/N: E195-4)

无水硫酸钠(分析纯，Fisher Chemical，P/N: S429-500)

苯并[a] 芘标准品(Dr. Ehrenstorfer GmBH，99.6 %)

标准品溶液制备

称取苯并[a] 芘标准品 5.39 mg，置100 ml 棕色量瓶中，以甲醇溶解定容至刻度;再精密量取该溶液1.0ml，以甲醇稀释定容至50ml，作为标准品储备液(浓度1.074 μg/ml)。取标准品储备液以甲醇逐级稀释为浓度分别为53.89、10.74、5.376、1.068、0.534、0.107 ng/ml 的标准工作溶液。

样品溶液制备

取样品，以绞肉机搅碎混匀后，准确称取2.0 g，加入无水硫酸钠2.0 g，置50 ml 离心管中，先后以乙酸乙酯20 ml 均质提取2 次，每次1 min，然后于8000 转/ 分下离心2 min;合并两次上清液，于55 ℃下旋转蒸发浓缩至2 ml 以下，以乙酸乙酯转移至10 ml 量瓶，定容至刻度，过0.45 μm 有机滤膜后待测。

加标溶液制备

取搅碎后样品2.0 g，准确加入1ml 标准品溶液，氮气吹干后，照样品溶液制备法“加入无水硫酸钠2.0 g…”及后续方法操作，即得。

色谱条件

分析柱：Acclaim Phenyl-1 3 μm，4.6 ×150 mm(P/N: 071969，S/N: 001059);

富集柱：Acclaim C8 5 μm，4.6 ×10 mm(P/N: 069696，Lot No: 101111);

流动相：流动相组成见表2;富集泵梯度及阀切换条件见表3;

流速：富集泵1.0 ml/min;分析泵1.0 ml/min;

进样量：10 μl;

柱温：35 ℃;

荧光检测器：激发波长290 nm，发射波长410 nm，灵敏度 1;

图2. 仪器连接图。

表2. 淋洗液组成及流速

表3. 富集泵( 左泵) 梯度淋洗条件

结果与讨论

标准品色谱图(1.068 ng/ml)

图3. 标准品测定色谱图。

样品及加标样品色谱图(加标量为 5 μg/kg)

图4. 样品及加标样品测定色谱图(上- 样品;下- 加标样品)。

样品前处理方法优化

分别采用乙腈、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷对样品进行提取，结果发现乙腈、异丙醇提取效率较低(回收率仅50%);正己烷极性太小，制得的供试品溶液油脂含量较大，可能导致固相萃取柱过载，且正己烷挥发性过强，可能影响进样精密度;而采用乙酸乙酯提取，回收率相对较好，富集泵可对SPE 小柱有效净化，减少不同样品间干扰;加入无水硫酸钠可对样品溶液进行脱水处理，进一步减少干扰。

色谱柱选择

富集柱选择：为了尽可能减少油脂成份在SPE 小柱上的洗脱时间，提高分析速度，优选Acclaim C8 作为在线SPE 柱。分析柱选择：分别选择Hypersil Gold C18、Accucore C18、

Acclaim Phenyl-1 色谱柱对样品和对照进行分离，结果发现Acclaim Phenyl-1(苯基柱)分析，苯并[a] 芘峰形最好，与其他杂峰的分离最佳，故最终选择Acclaim Phenyl-1 色谱柱作为分析柱。

方法的重现性

取浓度为1.068 μg/ml 的对照品溶液重复进样5 针，保留时间RSD 为0.04 %，色谱峰面积RSD 为0.96 %。制备加标量5 μg/kg 的供试品溶液5 份，分别进样1 针，保留时间RSD 为0.07 %，色谱峰面积RSD 为2.40 %。

图5. 加标样品重复性测定色谱图。

线性、检出限

取不同浓度苯并[a] 芘标准工作溶液依次进样10 μl 分析，在0.107 ng/ml ~ 53.89 μg/ml 范围，以苯并[a] 芘浓度和峰面积进行线性回归，标准曲线为A = 8254.2783 C + 208.3219，

相关系数1.0000。取浓度为0.107 ng/ml 的苯并[a] 芘对照品溶液，进样3 μl分析，苯并[a] 芘峰高值约为噪音值三倍，本方法检出限为0.3 pg(按对照品进样量折算);最低检出浓度为0.15 μg/kg(按供试品取样量折算)。

图6. 方法检测线测定色谱图。

实际样品的分析

取市售的样品，分别照GB/T 5009.27-2003 和本方法进行测试，结果见表4。

表4. 样品检测结果

取5# 样品进行加标回收试验(色谱图见图5)，加样回收率均在95 %~105 % 之间，平均回收率为98.51 %，RSD =2.40 %(n = 5)，说明本方法的准确度较高;采用国家标准GB/T 5009.27-2003(提取净化后的样品溶液采用纸色谱分离，荧光分光光度计测定)未能检出样品中苯并[a] 芘，初步推测是由于该方法灵敏度相对较低所致。