翻译后修饰蛋白质的定性和定量实验（二）

二、用 于 鉴 定 P T M 的富 集 技 术

2.1 磷酸化

丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的可逆磷酸化也许是研究最为深人的 PT M 。蛋白质磷酸化信号网络介导细胞对与不同的应激因子、生长因子、细胞因子以及细胞间相互作用作出响应。憐酸化还影响多种细胞进程，如增殖、凋亡 、迁移 、转录和蛋白质翻译（W hite，2008)。 在肿瘤、自身免疫疾病、代谢紊乱和传染性疾病中都涉及蛋白激酶和磷酸酶的异常调节（Blume-Jensen and H unter， 2001; Gatzka and Walsh， 2007; Sirard et al. ， 2007;T aniguchietaL ,2006)。一个磷酸化反应事件就会对细胞进程产生剧烈影响。例如, 养分剥夺、环境应激、某 些 小 R N A 病毒感染都会激发 eIF4E-结合蛋白的去磷酸化，进而导致 eIF4E-结合活性显著提高, 从而抑制翻译(Gingras et al. , 2001)。

传统的鉴定磷酸化位点的手段包括使用32P-标 记的 ATP(32P-Iabeled ATP) 或磷酸共培养细胞。磷酸化蛋白质组会摄取生长培养基中的放射性磷, 继而通过一些手段，如 2I>GE或高效液相色谱 (HPLC) 检测具有放射性的蛋白质。分离得到的蛋白质会被水解。所得的磷酸肽在 TLC 板中分离，随后利用 Edman 降解法进行测序。然而，这些方法非常费时，并需要大量相对纯的磷酸肽，而且必需使用大量放射性材料 (McLachlin and Chait，2001)。

由于以上缺陷，基于质谱的蛋白质组学迅速崛起，成为鉴定磷酸化的首选方法。近期—个 蛋 白 质 组 研 究 通 过 比 较 大 肠 杆 菌 co「）、乳酸菌< X ac(ococo« Zac汾）和枯草 芽 孢 杆 菌 )发现, 在介导碳代谢作用的糖酵解途径中的几乎所有的酶都在不同的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基发生了磷酸化 (SouH et al. , 2008)。 有趣的是，他们还发现检测出的磷酸化位点表现出的进化保守性远远高 于 一 级 序 列（Soufi et al. ，2008 ) 。 另一个研究小鼠肝脏磷酸化蛋白质组的结果发现，虽然鉴定出的许多磷酸化位点在 Swiss-P ro t数据库中已有注释(Pan et al. ， 2008)，然而鉴定位点中半数以上是新的，说明小鼠磷酸化蛋白质组中可能仍有许多磷酸化位点有待发现(Pan et al. , 2008)。

质谱法能够从复杂的蛋白质混合物中鉴定出特定的磷酸化位点，但是这种方法也确实会有一些问题，如在样品量有限、样品复杂度高或样品中蛋白质浓度动态范围广的蛋白质组学应用中时(White, 2008)。而将这些困难更为复杂化的是，磷酸化通常是亚化学计量 的 ，因 此 一 个 蛋 白 质 来 源 的 磷 酸 肽 的 浓 度 比 其 他 肽 段 的 浓 度 都 要 低 。大 量 未 修 饰 肽 段抑 制 了 质 谱 对 憐 fe肤 的 反应。. 这 个 现 象 会 导 致 目 的 憐 酸 肤 检 测 信 号 的 缺 失（McLachlinand C h a k , 2001)。这 可 以 通 过 多 种 富 集 技 术 减 少 与 P T M 变 体 相 关 的 未 修 饰 肽 段 含 量 ，从 而 减 少 这 种 抑 制 性 假 象 (suppression artifact) 。

其 中 一 种 应 用 于 憐 酸 化 鉴 定 的 帛 集 技 术 是 使 用 强 阳 离 子 交 换（strong cationexchange,S C X )树脂来选择性分离磷酸肽。研究发现, 在 p H 小 于 2.6 时 ，胰蛋白酶消化的磷酸肽不能被S C X 颗 粒 保 留（BeausoleiletaL , 2004)，这可能是由于磷酸基团荷载了更 多 的负电特性。 S C X 柱的流穿液可以用反相(R P )色谱柱分离，并用质谱分析 (Lim andKassel， 2006)。这种将磷酸肽从未修饰的相似物中分离出来的方法, 可以帮助减轻上述的质谱检测中的抑制问题。这种富集技术的优势在于既能在线（on— line)也能离线（offline)分离 。而劣势之一是它依赖于 S C X 树脂与磷酸肽的不可结合性 ，这点与其他一些通过与磷酸化残基结合，并因而能够选择性地富集磷酸肽的方法不同。

固定化金属亲和层析 (I M A C )是一种运用最为普遍的从复杂的消化蛋白质混合物中选择性分离磷酸肽的方法。这种方法通常利用一种金属螯合介质来结合三价金属离子，如 Fe34或 G a 3+ ( S y k o r a et al. ，2007)。这种带电树脂结合磷酸肽后, 先用洗涤液(通常是乙酸溶液)去除未修饰肽段，接下来可用磷酸盐缓冲液或者高p H 溶液洗脱磷酸肽。洗脱

的磷酸肽可直接过R P 柱脱盐用于下一步质谱分析，也可离线进行进一步富集或其他操作 。 然 而 ，I M A C 法确实存在一些复杂因素。如果携带多磷酸化位点的磷酸肽丰度较大，它们会覆盖 I M A C 树脂，导致单磷酸化或双磷酸化的磷脂肽保留较少。并且, 其他酸性肽段也会与 I M A C 柱发生亲和作用, 从而与鱗酸肽一起被富集。这一问题在应用于极度复杂的肽混合物(如全细胞提取物) 时会更加严重。为了避免该问题, 许多研究者试图通

过化学还原反应来甲基酯化酸性残基和C 端 (Ficarro et al. ，2 0 0 2 ) 。 然而 ，研究发现甲基酯化反应并不是定量的（Cirulli et al. ，2 0 0 8 ) 。 这 样 ，目的肽段的存在形式将是修饰过 、部分修饰或未修饰3 种 。这增加了混合物的复杂程度, 给定肽段的相对量实际上减少了（Cirulli et al. ，2 0 0 8 ) 。

另外一种类似于IM A C法的方法，使用二氧化钛(TiO2)作为金属螯合树脂的替代物(Larsen et al.，2005; Pinkse et al. ，2004; Thingholm et al. ， 2006)。正如 IM A C法中修饰肽段的磷酸基团与H 价金属有亲和力一样，在酸性条件下磷酸基团同样与二氧化钛分子有亲和作用（Larsen et al.，2〇05; Pinkse et al. ，2004 ; Thingholm et al. ， 2006)。通过转换到高P H 缓冲液中，磷 酸 肽 可 以 从 TiO2基质中洗脱下来。这种方法的优点在于 ，柱制备时间短，比 IM A X树脂洗涤循环数少。研究表明, 尽管这两种方法使用同样的亲和原理，但是它们却具有互补性—两种方法分别能够检测到不同磷酸肽（Cantiri et

al.，2007)。 IM A C 的特点是针对多磷酸化位点的肽段具备高亲和力，而二氧化钛则优先结合单憐酸化多肽 (Bodenmiller， e ta l. ，2007)。这表明在一个研究中同时使用两种方法能够最大限度覆盖憐酸化蛋白质组。

另外一类磷酸肽富集方法则利用化学方法在磷酸化位点引入亲和标签（Goshe etal.，2001; Oda e ta l. ， 2001)。 该方法利用碱性环境，通过卩-消除反应从磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基中去除 H 3PO4 (McLachlin andChait，2003; Oda et al. ， 2001); 进而通过

Michael-like加 成 反 应 ，将 一 个 二 巯 基 化 物 加 到 双 键 上 ; 接 着 用 结 合 了 生 物 素 的 烷 化 试 剂处 理 巯 基 ，得 到 的 生 物 素 化 肽 段 可 利 用 亲 和 素 柱 色 谱 来 富 集（图 40.1) (McLachlin andChait，2003)。这 个 方 法 的 一 个 难 点 在 于 ，由 于 生 物 素 与 亲 和 素 间 的 高 亲 和 力 ，回 收 标 签化 的 肽 段 成 为 问 题 。并 且 ，这 个 方 法 能 够 富 集 磷 酸 丝 氨 酸 、磷 酸 苏 氨 酸 ，却 无 法 富 集 磷 酸酪 氨 酸 。片 消 除 反 应 后 接 michael 加 成 反 应 同 样 会 改 变 O 联 片 JV-乙 酰 葡 糖 胺（O-

G l c N A c )修饰，这样会与磷酸化竞争富集作用 (W e lls e t al. ，2002)。最 后 ，在 , 消 除 反 应的碱性环境下，会发生不需要的副反应，导致对肽段质量造成无法预料的影响，从而使下游的肽段质谱鉴定变得更加困难。

在质谱过程中，必须考虑磷蛋白的特定化学性质。发 生 在 S 或 T 氨基酸上的磷酸化是不稳定的。传 统 的 断 裂 方 法 会 导 致 磷 酸 丝 氨 酸 和 磷 酸 苏 氨 酸 残 基 发 生 H 3PO4 , 或HPO3选择性中性丢失，并且先于肽键的断裂绝大部分憐酸化修饰都发生了片消除反应，仅 有 一小部分憐酸化修饰伴随着肽链断裂而保留下来（Bennett et al. , 2002; L e e et al. ，2001; M a et al. ，2001)。这会造成质量谱图中包含的测序离子变少，而且通常这些离子强度会变弱。最终较低的信噪比（图 40. 2)会妨碍对肽段序列的解释。尽管磷酸酪氨酸也可能丢失磷酸基团，但是很少像磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基一样产生强烈的中性丢失离子。一些质谱仪使用 E T D 避免这种中性丢失问题，产生的谱图既适合于序列分析也适合于憐酸化残基测定。我们在介绍用于蛋白质组学鉴定P T M 的设备时，将会进一步讨论这种断裂方法。

另外，中性丢失伪迹(neutral loss artifact)也 可 为 研究人员提供便利。中性丢失迹象是肽段中含有磷酸化位点的一个显著的指示信号。质谱中观察到的中性丢失峰通常由于其形成的优先性而具有高强度。因此，如果对于+ 1 价电荷肽段，发现前体离子丢失98 m /z(H3P4)或 80 m/z (H P0 3)，可以推断在肽段序列中存在一个磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残 基 。 现代质谱仪可以监测这种质量丢失。离子阱质谱仪能够分离中性丢失碎片，并开始另一轮 断 裂（MS3 scan) (Beausoleil et al. ，2004; Gruhler et al. ，2005; Olsen and Mann， 2004 ; Ulintzetal. ，2009)。 这个附加分析步骤的结果就是提供了额外的序列覆盖 范 围 ，从而帮助鉴定磷酸肽，并 将 P T M 匹配到特定氨基酸。另外 一 种 MS3¾ 描 的替代方 法就是运用于离子阱质 谱 仪 的磷酸肽断裂「Pseudo MS」」或称多级活化（M SA)(SChro e d e re ta l. ，2004)。这种方 法 在 M S /M S扫描肽段产生的中性丢失产物引入了 C I D 。 中性丢失离子产生的离子与初始MS/M S 产物离子一起被捕获得到复合谱。在 M S A 中 ，中性丢失离子被转变成一些结构上有益的碎片离子，这种离子在数据库搜索算法中的分数将会出现升高现象(Schroeder et al. ，2004; Ulintz et al. ，2009)。

磷 酸 化 给 肽 段 引 入 一 个 负 电 荷 ，这 也 将 影 响 质 谱 的 分 析 。当 阳 离 子 模 式 下 操 作 时 ，这个 负 电 荷 会 减 弱 质 谱 仪 响 应 (McLachlin and Chait，2001)，这 会 导 致 谱 图 质 量 变 差 ，并 使磷 酸 肽 鉴 定 更 加 困 难 。而 且 ，增 加 的 负 电 荷 会 降 低 质 谱 分 析 前 蛋 白 质 混 合 物 制 备 时 的 蛋白 质 水 解 作 用 。然 而 需 要 说 明 的 一 点 是 ，Harnio Steen与 同 事 发 现 , 在 使 用 电 喷 雾 电 离(electrospray ionization,ESI)选 择 性 研 究 磷 酸 肽 时 , 没 有 证 据 能 证 明 电 离 程 度 /探 测 效 率会 降 低（Steen et al. ，2006)。

作 为 一 种 替 代 方 法 ，Steve C a r r 和 同 事 提 出 了 前 体 离 子 扫 描 (precursor ion scanning)技 术 ，可 以 用 来 避 免 阳 离 子 模 式 运 行 质 谱 时 产 生 的 一 些 问 题 (Carr etal. ，1996)。 串 联 质谱 是 在 阴 离 子 模 式 下 运 行 ，并 且 磷 酸 化 残 基 会 产 生 特 征 性 的 碎 片 :P O 3— 大 小 为 一 79 D a ，P O 2— 大 小 为 一 63 D a 。当 在 前 体 离 子 扫 描 中 发 现 以 上 事 件 中 任 何 一 个 时 ，将 会 对 前 体 离子 进 行 M S /M S 检 测（Z a p p a c o s t a e t a L，2006)。这 种 方 法 检 测 磷 酸 肽 时 比 阳 离 子 模 式质 谱 灵 敏 度 更 高 (Carret a L ，1M 6) 。然 而 ，阴 离 子 谱 解 释 较 为 困 难 ，因 此 并 未 得 到 广 泛