细胞培养板的选择和使用

2020年10月16日 16:31:30 来源: Cellmax
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  细胞培养板作为培养细胞的一种常用和重要的工具,形状、规格、用途多样。

  你是否也为如何选择适合的培养板而迷茫?

  你是否正为如何方便、正确使用培养板而苦恼?

  你对如何处理培养板是否也有困惑?

  对不同的培养板各有什么妙用你又有何体会?

  细胞培养板的选择

  1)细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底(U型和V型);

  2)培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等;

  3)根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。

  平底和圆底(U型和V型)培养板的区别和选择

  1)贴壁细胞一般用平底培养板。

  2)悬浮型细胞的培养一般用V型。

  3)U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞 。

  4)V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。

  不同型状的板子自然有不同用途

  平底的什么类型的细胞都可用,但当细胞数目较少,如做克隆时,就用96孔平底板。

  另外﹐做MTT等实验时﹐无论贴壁和悬浮细胞﹐一般均用平底板。

  至于U或V型板﹐一般在某些特殊要求时才使用。如在免疫学方面﹐当做两种不同淋巴细胞混合培养时﹐需要二者相互接触以刺激。因此﹐一般需要U型板﹐因细胞会由于重力的作用而聚集在一个很小的范围內,V型板的用途更少﹐一般用于细胞杀伤实验时﹐为了使效靶细胞紧密接触﹐常使用V型板﹐但这种实验也可用U型板替代(加入细胞后﹐低速离心)。

  如果是养细胞的话, 通常是运用平底的, 另外要特別注意材质, 标示"Tissue Culture (TC) Treated"就是养细胞用的。

  圆底的通常是拿来做分析, 化学反应, 或是保存样品用。因为圆底比较好将液体吸得干净, 如果用平底的就不好吸了。 不过, 如果你是要测吸光值的话, 一定要买平底的才行。

  大部分细胞培养都用平底培养板,便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致,还便于MTT检测。

  圆底培养板主要用于同位素掺入的实验,需要用细胞收集仪收集细胞的培养,如“混合淋巴细胞培养”等。

  问题集锦

  问:我看到培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格 ,但不知道到底什么实验用哪种规格,请指教。

  答:要根据你具体的实验要求,流式一般用6孔,MTT一般用96孔,细胞爬片一般用24孔等!要具体根据你实验来定!

  问:请问哪位高手知道Terasaki板是什么培养板,与普通细胞培养板有什么区别?谢谢!!

  答:Terasaki plate主要是用于晶体学研究,产品设计便于对晶体的观察与结构分析。

  有两种sitting 和handing drop两种方法,两种方法应用产品的外形结构也不同。

  材料上选择crystal class polymer ,特殊的材料有利观察晶体结构。

  细胞培养板主要是PS材料。材料是treated sufface。便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料,同时还有low binding surface,有关更多实验材料上的应用与对材料的选择。

  问:我想测吸光度用酶标仪,用多孔细胞培养板行吗?请问酶标板 多孔细胞培养板有什么区别?

  答:用多空细胞培养板测吸光度肯定可以拉,我们经常用它来做样品的蛋白定量和MTT检测。

  区别:酶标板一般要比细胞培养板贵,细胞板主要做细胞培养,但也可以用来测蛋白浓度;酶标板包括包被板和反应板,一般不能用做细胞培养,它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测,它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。

  如下是个用酶标板检测冠状病毒IgM/IgG抗体例子

  【操作步骤】

  1.加样品:将标本稀释液100ul(或2滴)加到包被板内(预留阴阳性及空白对照2-5孔),将待检血清用PBS或生理盐水按1:20稀释后取10ul加入反应孔内。

  2.加对照:加入阴性对照1-3孔,阳性对照1孔,各100ul对照血清。空白对照1孔空置。

  3.温育:将反应板震荡使样品混匀后,置37℃温箱或水浴反应20分钟。

  4.洗板:用蒸馏水将浓缩洗涤液15ml稀释至300ml。(1)手洗:将反应板孔内容物倾出,将洗涤液注满反应孔,放置30秒钟后用力甩去,如此重复5次后拍干。(2)机洗:5次,每孔注入洗涤液200ul或注满,停留30秒钟后吸尽拍干。

  5.加酶标工作液:每孔加入100ul(或2滴)酶标工作液,置37℃温箱反应20分钟后,洗板5次,洗板操作同步骤4。

  6.显色和终止反应:将底物A、B液各50ul(或1滴)加到反应孔内,37℃避光显色10分钟。每孔加入终止液50ul(或1滴)混匀终止反应。

  【结果判定】

  1.酶标仪设定波长450nm,先用空白调零,然后测定各孔OD值;如果选用双波长测定,不必设置空白对照孔。

  2.当阴性对照平均OD值小于0.08,阳性对照(pc)OD值大于0.30时,说明试剂盒有效且实验操作正确,否则应当重复试验。

  3.临界值(CUT—OFF VALUE)=0.15+阴性对照平均(NC)OD值(当阴性平均OD值小于0.05时,按0.05计算;当阴性平均OD值大于或等于等于0.05时按实际值计算)。

  4.标本OD值≤临界值为阴性,标本OD值>临界值为阳性。

  常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量:不同孔板所加培养液的液面都不宜太深,一般在2-3mm范围,结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体(氧气)交换,而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。

  细胞培养板的密闭和污染问题

  细胞培养板的加样和操作:

  细胞培养板在进行细胞操作时同样遵循严格无菌的原则,各项操作要保证规范、科学,不对细胞的生长造成额外的影响。这其中最常见的问题就是如何保证加样后细胞的均匀和尽量减少换液对细胞生长状态的影响。

  问:

  96,24孔培养板或培养皿的盖子都很松,这样是方便了透气,但是细菌、霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢?

  答:

  盖子很松,属于半开放培养,这样的目的是透气(实际上是为了使培养皿外的CO2能够与培养皿充分交换,维持培养基的pH值)。

  凡事有利必有弊,这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发,这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的a培养箱内空气必须清洁(定期紫外线照,酒精擦洗,尽量少开关培养箱)b培养箱内的湿度必须始终保持为100%(培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽)。

  就好像培养皿,也是一个盖倒扣的容器,也不会污染。主要是因为盖子“L”型边缘产生气流负压的缘故,灰尘上面才附着有微生物,而气流携带的灰尘是无法通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散,不会产生气流,所以只会透气不会透菌。

  问:

  使用24孔板,在其中的某些孔中有操作(在超净台内),而其他孔中还有细胞要培养.我很担心这样会污染,不知道要注意什么?

  答:

  在超净台内如果操作规范的话应该可以的,我想你可以充分利用培养版的盖子,尽量只暴露要操作的孔,将其他孔用盖子盖起来。

  使用前综合考虑一下,充分使用所有的孔;如果只需要使用少数的孔可以只用一边的,其余用盖子盖住,我习惯于先用右侧的孔(右手加样方便)。

  操作时用几块玻片把板子一侧垫高,不要把盖子全打开,一般没问题。

  细胞分布不均及解决办法

  问:

  细胞接种培养板,细胞总是聚集在周边部分,该如何处理啊?

  答:

  请问你的细胞是如何混匀的?是滴管吹打还是振荡培养板?如果是后者,而且是转圈摇匀的话,很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分,导致细胞中间少,四周多!

  这里提供一个好办法:在培养种板之前,把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出,种入细胞时力量要轻,可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中,培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡,否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。

  培养板孔直径愈小,这个现象越明显,24、96孔板这种现象不可避免,因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面,而是周边高,就像凹镜一样,而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液,使得细胞随培养液一起出现“边集”现象,如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话,这要看你需要观察何种指标,如果是MTT ,免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。

  消化细胞时要注意吹打均匀,避免细胞成团,而且孔内培养液量要足够,一般接种时加足量培养液,加干预时换一次液,干预液加培养液量等于接种时培养液量,这样的话“边集”现象会有所改观,不妨一试。

  问:

  我做的是空斑形成实验,最好是细胞铺成均匀的一层,,可接种病毒时大部分孔都还好,个别的不太均匀。细胞组内差异很大,想请教一下大家加细胞的时候都有什么方法呀?

  答:

  细胞消化后吹打成单细胞悬液很关键!保证分板时每个孔的细胞数目是一致的!

  当然还有处理因素各个孔之间的平行也很重要,比如说加药时,药物稀释后混匀,保证每个孔的浓度是一致的!

  再者加细胞和药物时,要试验组和对照组一块轮流加,避免加样先后顺序导致细胞密度和药物浓度的差异!

  问:

  吹打已经是均匀了,但是铺板,6孔,24孔总有些不均匀,有点往中间集中。而且明明计数好了铺,长一两天,各个孔密度又不一样,对检测有影响,有良策吗?

  答:

  如果用巴氏吸管铺的话,每次吸取的量不要太多,因为吸管内的细胞会自动向下沉,往往第一开始几个孔细胞数多,经常均匀细胞悬液,加液走S型路线。

  如果用移液器的话,tips要处理下,把尖端去掉避免损伤细胞,这样每一次取液对应一个孔。用tip一对一孔加入比较准确。但也要注意混匀悬液。

  设立平行组,n要足够大(可以计算一下)。

  铺板后不要摇,因为摇动会导致细胞向中间聚集。最好铺板一次搞定。


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