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Western Blot实验高效和标准-优化封闭、抗体孵育和洗涤流...

2021.3.01

Western Blot实验高效和标准-优化封闭、抗体孵育和洗涤流程的操作

从时间成本，金钱成本，以至于感情投入角度来评判，论实验室常规的基础实验哪一个具备最低的投入产出比，相信大家都会选择Western Blot实验。各位正在科研道路上奋战或者已经成功打怪升级的同学们细数一下那些年你做的Western Blot，再数一下最后发表文章用到的Western Blot结果图，相信比例低于1%的不在少数。

那么缘何Western Blot具有如此低下的投入产出比呢？仔细品品，Western Blot实验并非是一个非常复杂的实验，然而影响因素却极其多，其中有些是可控的，有些是需要经验判断的，而有些只是需要留意实验操作细节，就能够做好的。而整个流程中，大家往往会非常重视那些不可感知的实验条件，通过标准化的流程固定参数，以减少实验组和样品之间的偏差，比如样品的获取过程，通常会固定裂解液的种类，用量，时间等等因素；比如电泳过程，通常会固定电压或电流，并通过预染maker的指示固定电泳的总时间，也可以通过购买预制胶减少电泳胶批次之间的误差；比如转膜和曝光，也可固定操作时间尽量减少误差。但是这其中，最简单的操作部分，却往往被忽视了，那就是封闭，洗涤和抗体孵育部分。

诸如上样，电泳，转膜，曝光流程，这些步骤的实验相对比较独立，不受其他人实验的干扰，且通常是一次性的步骤，大家往往会遵守严格的操作流程。而封闭，洗涤和抗体孵育部分，由于是多次反复的操作，且经常和其他实验室人员共享摇床平台，因此往往很难固定一个统一的标准。比如，实验室很多的简易摇床并无控制振荡速度和频率的按钮和参数；比如在封闭或孵育的时候遇到其他人员需要洗涤而对摇床的速度进行了调整，反之亦然；比如洗涤过程中没有固定洗涤液的体积而是随意倒入一定的量，甚至有时候倒入洗涤液的时候直接冲击在膜上；比如多次洗涤的时间间隔不统一，有时候因需要配合其他实验的安排而延长/缩短洗涤时间，或者增加/减少洗涤次数等等。由于Western Blot实验的封闭、洗涤和抗体孵育的效果很大程度上取决于时间，分子扩散，液体交换效率等因素，因此上述各种条件的不统一，综合下来会影响封闭的效果，抗体结合的效率和特异性，背景的干净程度。虽然每次实验都会以内参来衡量不同样品之间的差异，但是多次实验之间却因为以上各种因素的不统一，导致较大的实验偏差。因此将以上多次反复的简单操作进行标准化，可极大提高Western Blot的稳定性，减少重复次数。

除此之外，封闭，洗涤和抗体孵育部分也是整个Western Blot中最耗时但却没有技术含量的部分，通常这几个步骤的总时间会占用Western Blot的1/2以上，并且在这期间，需要研究人员时刻待命进行抗体和洗涤液的更换，严重影响了进行其他实验的安排。并且基于以下2个原因，很多人选择一抗过夜，将Western Blot分成2天之内完成。其中一个原因是担心抗体的特异性不行，背景高，因此选择低温孵育过夜以提高特异结合和降低非特异背景；第二个原因是第一天进行整个Western Blot的实验流程会导致做到晚上很晚的时间。通常一抗孵育过夜之后，第二天早上进行洗涤，二抗孵育，洗涤，曝光，往往要到中午或者午饭后才能出结果，然后再决定当日是否需要继续调整样品重新进行新一轮的Western Blot实验，其中留给数据分析和思考如何优化下一步流程的时间比较少，因此容易陷入未经详细思考，便仓促进入下一个实验流程的恶性循环中。

那么如何解决以上关于封闭，抗体孵育和洗涤这类简单的重复劳动带来的对整个Western Blot流程和结果的影响呢？唯一的解决方案就是对这几个步骤进行标准化和自动化，以减少人工的干预，以及有效利用凌晨的时间。目前市场上推出不少可解决这些问题的小型自动化设备，比如美国Cellagen Technology公司的Flexiwash FW400

点击此链接观看实验操作视频https://v.qq.com/x/page/b0927otglfx.html）

FlexiWash FW400自动化免疫杂交系统，实现了对繁琐耗时的Western blots膜的孵育和洗涤过程的自动化和标准化过程。在蛋白被转移到杂交膜上之后，可将杂交膜装载到FlexiWash FW400工作站中进行自动封闭、孵育和洗涤循环。实验人员仅需要准备相应体积的试剂，启动免疫杂交流程，即可让FlexiWash FW400完成剩下所有的工作，直至曝光前。独有的液体处理设计，使得FlexiWash FW400支持4批样品的同时孵育/洗涤，每个样品可独立进行编程，互不干扰。

节约时间和成本