流式细胞术在血液学中的应用（二）

二、 流式细胞术在血液病学中应用

（一）白血病的分类研究
    B-cell  ALL
    1.TdT  positive.
    2.CD10  positive,  except  for  progenitor  B-cell  ALL.
    3.HLA-DR  positive.
    4.CD19  frequently  present  without  CD20.
    5.Positive  cytoplasmic  μ  chain  in  pre-B-cell  type  only.
    6.Monoclonal  surface  immunoglobulin  in  L3  only.
    7.Immunoglobulin  gene  or  T-cell  receptor  gene  rearrangement.

    T-cell  ALL
    1.Positive  TdT.
    2.Usually  negative  CD10  and  HLA-DR  (more  frequently  positive  in  adult  T-ALL).
    3.CD7  is  frequently  the  only  positive  T-cell  marker,  but  all  T-cell  markers  can  be  present.
    4.T-cell  receptor  gene  rearrangement.

    Acute  Myeloblastic  Leukemia  without  Maturation  (M1)
    1.Greater  than  90%  of  myeloblasts  in  the  bone  marrow.
    2.Greater  than  3%  MPO-positive  blasts  in  the  bone  marrow.
    3.Blasts  positive  for  CAE.
    4.Blasts  positive  for  CD33/CD13,  HLA-DR.
    5.Blasts  negative  for  CD14,  CD15,CD41/CD61,glycophorin.
    6.Immunoglobulin  and/or  TCR  gene  arranged  in  mixed-lineage  leukemia.
    7.Specific  cytogenetic  abnormalities:  t(9;22)(q34;q11)  and  inv(3)  (q21;q26).

    Acute  Myeloblastic  Leukemia  with  Maturation  (M2)
    1.30-90%  of  myeloblasts  present  in  bone  marrow.
    2.Less  than  20%  monocytic  precursors  in  the  bone  marrow
    3.Less  than  5×10  9  /L  monocytic  precursors  in  the  peripheral  blood.
    4.Cytochemical  stain  for  blasts:  Positive  for  myelo-peroxidase  and  chloroacetate  esterase  but  negative  for  α-naphthyl  butyrate  esterase.
    5.Monoclonal  antibody  panel:Positive  for  CD13,CD15,CD33,HLA-DR,but  negative  for  CD14.
    6.Specific  cytogenetic  abnormality:  t(8;21)(q22;q22).

    Acute  Promyelocytic  Leukemia  (M3)
    1.Presence  of  more  than  30%  hypergranular  (or  hypogranular)  promyelocytes  in  the  bone  marrow.
    2.Presence  of  multiple  Auer  rods  in  the  cytoplasm  of  leukemia.
    3.Cytochemical  staining:  Strongly  positive  for  myeloperoxidase  and  chloroacetate  esterase,  but  negative  for  a-naphthyl  butyrate  esterase.
    4.Immunophenotypeing  :  Positive  for  myelomonocytic  antigens  (CD13,CD15,CD33),negative  for  monocytic  antigen  (CD14)  and  HLA-DR.
    5.Abnormal  karyotype  :  t(15;17)  detected  by  cytogenetic  or  molecular  biological  techniques.
    6.Coagulation  work  up:  Decreased  platelets  and  fibrinogen;  prolonged  prothrombin,  activated  partial  thromboplastin  and  thrombin  times,  and  increased  levels  of  fibrin  degradation  products.

    Acut  Myelomonocytic  Leukemia(M4)
    1.Presence  of  at  least  30%  myeloblast-monboblasts  in  bone  marrow.
    2.Monocytic  component  :  More  than  20%  but  less  than  80%  in  bone  marrow.
    3.If  monocytic  component  is  less  than  20%  in  the  bone  marrow.
      A.Monocyte  count  in  peripheral  blood  should  be  greater  than  5×10  9  /L.
       B.Serum  lysozyme  concentration  should  exceed  three  times  the  normal  value.

    4.Myeloblasts  :More  than  20%  in  bone  marrow.
    5.Myeloperoxidase  positive  cells  :  More  than  3%.
    6.Chloroacetate  esterase  and  a-naphthyl  butyrate  esterase-positive  cells:  Roughly  more  than  20%  each.
    7.Abnormal  chromosome  16  in  M4  :  Associated  with  M4  EO  subtype.
    8.Immunophenotype  :  Positive  for  CD13,CD14,CD15,CD33,and  HLA-DR  ,negative  for  CD41/CD42/CD61  and  glycophorin  A.

    Acute  Monoblastic  Leukemia  (M5)
    1.Presence  of  more  than  80%  monocytic  component  among  the  nonerythroid  cells  in  the  bone  marrow.
      A.M5a:  80%  or  more  of  monocytic  components  are  monoblasts.
      B.M5b:  Predominantly  monocytes  and  promonocytes.
    2.Elevation  of  serum  and  urine  lysozyme  levels.
    3.Cytochemistry:
      Myeloperoxidase  :  may  or  may  not  be  positive.
      Nonspercific  esterase  :  strongly  positive  .
      Specific  esterase  and  periodic  acid-Schiff:  usually  negative  .
    4. Immunophenotype  :  Positive  for  CD11c,CD13,CD14,CD15,CD33,HLA-DR,negative  for  CD41,  CD42,  CD61    and    glycophorin.
    5. Cytogenetics  :  Association  with  t/del(11)(q23).

    Acute  Megakaryoblastic  Leukemia  (M6)
    1.Presence  of  at  least  50%  erythroblasts  among  all  nucleated  cells  in  the  bone  marrow.
    2.Presence  of  at  least  30%  myeloblasts  among  all  nonerythroid  cells  in  the  bone  marrow.
    3.PAS  positivity  in  all  mature  and  immature  nucleated  erythroid  cells.
    4.Glycophorin-A  antibody  or  other  erythroid  antibodies:  The  only  reliable  antibody  for  phenotyping.
    5.React  variably  to  myelomonocytic  (CD13,CD33)  and  platelet  (CD41)  antibodies.
    6.Most  frequent  cytogenetic  abnormalities:  -5/5q-  ,-7/7q-  .

    Acute  Megakaryoblastic  Leukemia  (M7)
    1.Presence  of  30%  or  more  megakaryoblasts  in  the  bone  marrow.
    2.Excess  of  blasts  with  increased  numbers  of  maturing  megakaryocytes  in  bone  marrow  biopsy  ,  plus  identification  of  megakaryoblasts  in  the  peripheral  blood  and  bone  marrow  aspirate  by  immunologic  techniques.
    3.Electron  microscopic  identification  of  platelet  peroxidase  in  leukemic  cells.
    4.Monoclonal  antibodies  :  CD41,CD42,and  CD61  are  specific  for  megakaryoblastic.
    5.Myelomonocytic  markers  :  Positive  for  CD33  but  negative  for  CD13,CD14  and  CD15.
    6.PAS  Staining  pattern  in  megakaryocyte-megakaryoblasts  :  Periphery  of  cytoplasm  and  concentrated  on  cytoplasmic  blebs.
    7.t(1;22)(p13;q13):  Specific  for  M7  infants.

（二）白血病细胞动力学
    1、不同类型急性白血病细胞动力学差异不大。
    2、RNA含量与细胞增殖活性呈正相关，G1期细胞DNA含量高于G0期。RNA高的细胞具有较高的增殖能力。
    3、治疗前RNA高的急性白血病，化疗效果好，缓解期较长；RNA含量越低，则更多的细胞处于G0期，化疗效果差，不易缓解。一旦获得缓解，缓解期相当长。
    4、DNA非整倍体是恶性细胞的标志，但急性白血病的DNA非整倍体检出率低于实体肿瘤。

（三）预测化疗效果和微小残留病变（MRD）
    1、小剂量阿糖胞苷（Ara-C）由于阻断DNA的合成而使S期增高；
    2、小剂量阿糖胞苷（Ara-C）由于杀死S期细胞而使S期减少；
    3、应用FCM动态观察化疗前后细胞动力学参数的变化，发现化疗有效者，化疗后S期和RNA  指数下降比无效者明显，且S期恢复较快。
    4、MRD是白血病复发的根源。
    （1）DNA非整倍体监测化疗效果；探测1%-3%残留白血病细胞；有DNA非整倍体的缓解期白血病多在三个月内复发。
    （2）检测白血病相关抗原
    CALLA+/TdT+  抗原监测急淋或TdT+/CD5+抗原监测T细胞急淋。
    （3）运用FCM分选感兴趣细胞分子水平的研究，如PCR、FISH等。

（四）其他恶性血液病的应用
    1.骨髓增生异常综合征（MDS）
    （1）依细胞动力学特点可分为RA、RARS、RAEB、CMML。
    （2）低S期者预示生存期短。
    （3）DNA非整倍体可作为MDS转化为白血病的早期指标。
    2.慢性淋巴细胞白血病（CLL）
    （1）表面Ig荧光强度弱是CLL的特点，借此区别慢性淋巴细胞性淋巴瘤和幼稚淋巴细胞性白血病。
    （2）慢淋的细胞动力学特点是骨髓和外周血的S期低（0.2），而淋巴结的S期却高达60%。其RNA含量低于正常淋巴细胞，通常难以发现DNA非整倍体。
　　3.慢性粒细胞白血病（CML）
　  （1）CML是一种累及多种细胞系的白血病。
    （2）90%以上CML  Ph+，借此可探测MRD。
    （3）CML急变时，可发现DNA非整倍体，急粒变时RNA升高，急淋变时RNA  下降。
    （4）CML细胞动力学与正常造血细胞没有明显差异。
    4．淋巴瘤
    （1）大多数低危淋巴瘤的DNA多为二倍体或近二倍体。
    （2）滤泡性淋巴瘤为近二倍体或近四倍体。
    （3）弥漫性大细胞淋巴瘤多为高二倍体，Burkitt淋巴瘤为二倍体或高二倍体。
    （4）滤泡性淋巴瘤主要表达B细胞标志，但不表达CD5，可区分滤泡性淋巴瘤白血病和CLL，区别Burkitt淋巴瘤（SIgG+，CD10-）和小细胞无核裂淋巴瘤（SIgG+，CD10+）。
    （5）何杰金氏病多为二倍体，增殖活性不高，10%病人可为四倍体或高四倍体，伴有较多R—S细胞（CD15+、CD30+）。
    5．骨髓瘤
    骨髓瘤是干细胞疾病，其DNA非整倍体探测率高于其他恶性血液病（60%-80%），增殖活性低，RNA含量高，这些参数在不同类型的骨髓瘤中有一定预后意义。

（五） 分选造血细胞
    分选细胞是FCM的又一重要功能，目前主要用于：
    （1）骨髓移植，清除自身骨髓中恶性细胞或异体骨髓中参与移植反应的细胞。
    （2）分选造血干细胞。
    （3）进行分子生物学研究。

三．FCM在白血病基因产物的表达和细胞凋亡的检测

1．P53基因
    P53是一种抑癌基因产物，此基因突变是包括白血病在内的恶性肿瘤常见的遗传学
变化。
2．P21ras原癌基因
    其编码蛋白均为P21，对细胞分化生长起重要作用，其活化也是肿瘤发生的主要原因之一。
3．Bcl-2抗凋亡基因 
    Bcl-2高度表达不仅可抑制白血病细胞凋亡，使其长期存活，而且对治疗反应差。
4．凋亡  （apoptosis）
    凋亡也称细胞程序性死亡（programmed　cell  death，PCD）是细胞自我死亡的一种形式，是基因导向的细胞自我破坏的过程，通过细胞内核酸内切酶使核小体间DNA裂解，细胞死亡巨噬细胞清除。
5．P170多药耐药基因
    其mdr-1编码P170蛋白是细胞膜泵，将进入细胞内的化疗药物主动泵出细胞，使细胞内药物和浓度降低，白血病细胞表达P170，则诱导缓解率减低，复发率高和持续缓解时间短。
6．谷胱甘肽转移酶（GST）
    GST主要涉及细胞解毒包括对某些化疗药物的分解，使进入细胞内的药物浓度降低。
    FCM具有多参数检测的优点，一次可检测细胞周期分布、DNA倍体，P53、P21、bcl-1、P170、GST、凋亡等，并可研究参数间相互关系。随着特异单克隆抗体的增多，FCM检测的项目也越来越多，其快速、简便、同一标本可检测多项等到特点使FCM  至今应用不衰。

四．FCM在器官和骨髓移植的应用

（一） 移植前 
    1．交叉配型
    2．监测骨髓中的肿瘤细胞或造血干细胞
（二） 移植后FCM可用于监测移植后血液或植物内免疫成分的变化，以预测移植后免疫排斥反应、细胞免疫抑制治疗效果和移植物存活情况。

五．FCM在免疫血液病中的应用
 
    FCM在免疫血液病的应用主要有以下几方面：
    1．定量测定结合在细胞膜上免疫球蛋白或补体，协助自身免疫性溶血性贫血的诊
断。
    2．探测少见的细胞群，如骨髓移植后所出现的嵌合体。
    3．探测血小板和白细胞抗体，协助诊断血小板减少性紫癜和输血后免疫性血小板 
减少。
    4．检测细菌、病毒、寄生虫以及其所引起的免疫反应，协助感染性疾病的诊断和病原体确立。

    FCM在血液学有广泛的应用前景，特别是随着免疫标记物的发展，FCM程序化和质量控制的采用，以及与分子生物学完美地结合，将会对血液学定量研究产生巨大推动力。