高效液相色谱流动相的注意事项
一、普通C8及C18反相色谱柱
当色谱柱使用较长时间之后，就可能发生柱压升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等情况，这时就需要根据故障原因对色谱柱进行清堵与再生，以延长色谱柱的使用寿命。具体原因及处理方法如下：
１）筛板堵塞与柱头塌陷
主要现象有柱压严重升高或不稳定、色谱峰拖尾、色谱峰变宽、色谱峰分叉、秃峰等，需要进行清堵与弹性复原处理。（此方法适合于任何类型有相同故障的色谱柱的处理，不同的是溶剂要与相应类型色谱柱匹配。）主要处理方法如下：
①一般情况下，将色谱柱反接，不接检测器，用纯水或水－有机相（多用甲醇、乙腈）（95：5）以0.6ml／min流速冲洗约4h→再正向连接，接或不接检测器，用纯水或水－有机相（多用甲醇、乙腈）（95：5）以0.6ml／min流速冲洗约1h→再提高流速至1.0ml／min冲洗1h，观察柱压变化。若不凑效，则拧开柱头螺母（色谱柱进口），小心取下筛板，用５％左右的硝酸溶液超声处理20min左右，再用纯水超声20min左右。用小勺清理掉柱进口污染的部分填料，再将用乙醇调和后的相应的硅胶装入柱入口（也可用已经报废的同类柱中的填料替代），用平面不锈钢小铲压紧填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否则，压得太紧柱压会升高，然后装上清洗过的筛板，注意筛板安装方向必需与原装相同，最后紧固。
②冲洗与饱和：清堵紧固后，先反向连接色谱柱，不接检测器，用纯水或水－有机相（多用甲醇、乙腈）（95：5）以0.3ml／min流速冲洗约4h→再换成甲醇以0.5ml／min流速冲洗约2h→再正向连接色谱柱，接或不接检测器，用纯水或水－有机相（多用甲醇、乙腈）（95：5)以0.3ml／min流速冲洗约2h→再换成甲醇以0.5ml／min流速冲洗约1h→然后用甲醇或乙腈以1ml／min流速冲洗约1h以上，再根据测试用流动相比例调整水－甲醇（或乙腈）比例，以1ml／min流速冲洗约1h，最后用测试用流动相平衡2h，进样测试即可。
③特别说明：如不是特殊情况，按其他办法可行，则最好不要反冲色谱柱和拆卸筛板。
２）柱效降低
主要特征性现象有柱压基本正常，但出现拖尾峰、秃峰、分叉峰、前延峰、峰变宽、基线漂移、理论板数降低、分离度降低等。需要进行再生处理，具体方法如下：
①一般情况下，顺接色谱柱，按如下溶剂顺序及条件冲洗95％水－5％甲醇（或乙腈）（1.0ml／min，1h以上）→100％甲醇（1.0ml／min，1h以上）→100％乙晴（1.0ml／min，1h以上）→75％乙晴－25％异丙醇（0.5ml／min，10倍柱体积以上）→100％异丙醇（0.5ml／min，10倍柱体积以上）→100％二氯甲烷（0.5ml／min，10倍柱体积以上）→100％正己烷（0.5ml／min，10倍柱体积以上，根据实际情况可忽略）→100％异丙醇（0.5ml／min，20倍柱体积以上）→95％水－5％甲醇（或乙腈）（0.5ml／min，30min；再升至1.0ml／min，10倍柱体积以上）→检测用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试。在冲洗过程中，随时关注柱压变化，确保不超过4000psi；若超出，可通过降低流速，升高柱温来调整，具体操作可咨询具备相关专业知识背景和实践经验的人士。
②若上述方法效果不理想，可按如上溶剂顺序和条件，先反接色谱柱冲洗→再顺接色谱柱，用100％乙腈以1ml／min流速冲洗约2h→再用与流动相同比例的水－有机相以1ml／min流速冲洗约30min→最后用流动相平衡2h或至基线平稳，进样测试即可。
③特别说明：再生过程必须随时关注柱压变化，柱压过高易导致硅胶变形与开裂及键合相极性端连接顺序紊乱，同时要保证再生时间足够。
３）再生
当分析复杂样品时间过长，尤其是中药分析，若出现柱压正常而色谱峰形变差，分离度降低时可尝试如下方法再生：先用5％甲醇（或乙腈）－95％水，将色谱柱反向连接，以1ml／min冲洗60分钟以上→再用四氢呋喃（或丙酮）以0.5ml／min冲洗60分钟以上（去除脂类）→再用65％甲醇（或乙腈）－35％水，以流速1ml／min冲洗60分钟→然后用纯甲醇或乙腈冲洗30分钟→接着用与流动相同比例的水－有机相以1ml／min流速冲洗约30min→最后用流动相平衡2h，进样测试即可。
４）特别提醒
再生时最好选择不具备在线脱气的独立泵送系统色谱仪器进行，以防正相溶剂损坏脱气机密封膜或分子筛及比例阀等仪器精密部件。
二、正相色谱柱
１）氨基柱
①在正相条件下使用时，故障率较低。但要注意不可进样含有醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要彻底脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量较差的乙醚、四氢呋喃等溶剂中含有少量）。任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶，若不互溶，必需用异丙醇过渡。
当使用氨基柱进行酸性物质分析时，酸性物质溶液有质子存在，会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后被测成分保留性质有所改变或柱效下降。
这时，建议按如下方法处理：首先用异丙醇，以0.5ml／min流速，冲洗约50倍柱体积→然后用甲醇，以0.5ml／min流速，冲洗约50倍柱体积→再用异丙醇，以0.5ml／min流速，冲洗约10倍柱体积过渡，回到平常使用的正相流动相平衡2h，进样检测即可。
若上述方法不凑效，可尝试按以下程序冲洗与再生：首先用含0.5％～1.0％NH3的50％乙腈－50％水溶液，以１1.0ml／min流速冲洗该柱约5～10倍柱体积→然后用不含NH3的50％乙腈－50％水溶液，以1.0ml／min流速冲洗该柱约5～10倍柱体积以洗去多余NH3→再用添加少许NH3（如0.1％）的酸性分析物的流动相平衡2h左右，进样检测即可。
②在反相条件下使用时，－NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱效会下降很快，所以故障率较高。
若出现柱压增高柱效降低等情况，建议采用如下方法处理：若流动相含有缓冲盐，先以流动相比例的水－有机溶剂，以检测分析时同流速冲洗约30倍柱体积→再用纯甲醇，以1.0ml／min流速冲洗约50倍柱体积→然后用异丙醇，以0.5ml／min流速冲洗约10倍柱体积过渡→再用二氯甲烷以0.6ml／min流速冲洗色谱柱约10倍柱体积→再用异丙醇以0.5ml／min流速冲洗约10倍柱体积过渡回到甲醇条件下，以1.0ml／min速冲洗约10倍柱体积，密封保存或用流动相平衡2h左右（若流动相含有缓冲盐，需先用与流动相同比例的水－有机相以1.0ml／min流速冲洗约30min），进样检测即可。
若上述方法不凑效，可尝试如下程序冲洗与再生：95％水－5％乙腈，以1.0ml／min流速冲洗约10倍柱体积→THF四氢呋喃），以0.6ml／min流速冲洗约10倍柱体积→95％乙腈－5％水以1.0ml／min流速冲洗约10倍柱体积→保持95％乙腈－5％水，以低流速0.2－0.5ml／min冲洗过夜→流动相平衡2h（若流动相含有缓冲盐，需先用与流动相同比例的水－有机相以1.0ml／min流速冲洗约30min），进样检测即可。
２）氰基柱
①在正相条件下使用时，故障率较低，操作和维护与氨基柱基本完全相同。但当柱子使用一定时间后，若出现柱效下降，柱子老化，可通过冲洗再生来恢复其柱性能。
具体方法如下：
用氯仿以0.5ml／min流速冲洗约10倍柱体积→再用异丙醇以0.5ml／min流速冲洗约10倍柱体积→然后用二氯甲烷以0.5ml／min流速冲洗约10倍柱体积→再用流动相（pH1.5－7.0为佳）平衡1h，待基线平稳，进样检测即可。
②在反相条件下使用时，－CN键会水解，尤其是在pH1.5－7.0范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱效会下降很快，所以故障率较高。如果在这个条件下使用，一定要注意及时清洗。若出现柱效下降，柱子老化，可通过冲洗再生来恢复其柱性能。
具体方法如下：若流动相含有缓冲盐，先以流动相比例的水－有机溶剂，以检测时同流速冲洗约30倍柱体积→再用95％水－5％乙腈以1.0ml／min流速冲洗约10倍柱体积→再用THF（四氢呋喃）以0.6ml／min流速冲洗约10倍柱体积→再用95％乙腈－5％水以1.0ml／min流速冲洗约10倍柱体积→再用流动相平衡2h（若流动相含有缓冲盐，需先用与流动相同比例的水－有机相以1.0ml／min流速冲洗约30min），进样检测即可。
若上述方法不凑效，可尝试如下程序冲洗与再生：用95％水－5％乙腈以1.0ml／min流速冲洗约10倍柱体积→再用THF（四氢呋喃）以0.5ml／min流速冲洗约10倍柱体积→再用95％乙腈－5％水以1.0ml／min流速冲洗约10倍柱体积→保持95％乙腈－5％水继续冲洗，以低流速0.2～0.5ml／min冲洗过夜→流动相平衡2h（若流动相含有缓冲盐，需先用与流动相同比例的水－有机相以1.0ml／min流速冲洗约30min），进样检测即可。
三、阴／阳离子交换柱
１）阳离子交换柱常见故障与处理
离子交换柱属于较脆弱的色谱柱，阳离子交换柱在使用过程中，往往会由于不规范操作而导致一系列故障。常见故障如下：
①柱压升高伴随柱效降低：主要是由于系统管路或柱保存过程中柱内或长菌、样品溶液中的颗粒物积聚在烧结物或者柱床上等所致。
②色谱峰额外地展宽：主要是由于管路太长、非新鲜配制的流动相中含有不正确的阴离子、流动相ｐＨ与离子强度不正确、用流动相平衡时间不够等所致。
③柱压正常伴随柱效降低：主要是由于样品中有脂肪，油脂，脂质等有机物致使固定相的表面被覆盖、从样品中带来的不确切的有机物或未正确制备洗脱液、在洗脱液制备完成以后带入洗脱液中的非特定有机物（eg.运输时从大气中带来）。
针对上述情况，在使用离子交换柱过程中需特别注意即可避免。若已经产生故障，可根据实际情况处理，尝试按如下方法再生：ｖ首先反接色谱柱→用1mol／L的硝酸铵溶液，以0.4ml／min的流速洗脱30ml～60ml→再用甲醇－水（40：60），以0.4ml／min的流速洗脱30ml～60ml→然后用异丙醇，以0.4ml／min的流速洗脱30ml→再用去离子水，以0.4ml／min的流速洗脱30ml→然后用检测用洗脱液，以0.4ml／min的流速洗脱30ml→最后将柱子接回正常方向，用检测用洗脱液平衡至基线平稳，进样检测即可。
２）阴离子交换柱常见故障与处理
同阳离子交换柱。不同的是，阴离子交换柱在不正确的较低pH条件下会导致系统峰（溶剂峰＋硫酸盐峰）逐渐前移和峰向（正与负）针针变化。处理：正确配制新鲜的pH在3.8－4.3之间的洗脱液。若出现与阳离子交换柱相同的常见故障，处理方法同阳离子交换柱。
３）测试
部分离子交换柱要求不同，可采用0.05mol／L的硫酸溶液（阳离子交换柱）或0.05mol／L的氨水溶液（阴离子交换柱），反向连接色谱柱，以0.3ml／min流速过夜冲洗→换成去离子水，以0.5ml／min流速，冲洗约12h→再正向连接色谱柱，用流动相平衡至基线稳定（若流动相中含有缓冲盐，需先用超纯水以0.5ml／min流速冲洗约10倍柱体积，再进行平衡），进样测试即可。
四、手性柱
手性色谱柱在使用过程中往往会由于操作不当而导致一系列问题，现以AGP柱为例加以说明和规范。
１）常见故障原因及处理办法
①手性异构体无法完全分离：多为色谱条件不妥，需要重新考察色谱条件。
②峰形变差，诸如拖尾、分叉、前延：多为色谱柱污染、柱床硅胶溶解与柱头塌陷（往往是由于流动相pH超过8.0或流速及柱温选择不当导致）、柱床干涸等，需要清洗筛板、更换柱头硅胶，具体方法参考C18柱。
③柱压升高到100bar以上：多为色谱柱污染、柱头塌陷等，需要清洗筛板、更换柱头硅胶，具体方法参考C18柱。
２）再生补救措施
手性柱若用时过久，在保证色谱条件正确与操作得当的情况下，若出现上述故障，可尝试按如下程序再生：
清洗筛板、更换柱头硅胶→反接色谱柱，用纯水以0.2ml／min流速冲洗约4h→用25％异丙醇溶液以0.2ml／min流速冲洗过夜→再顺接色谱柱，用纯水以0.2ml／min流速冲洗约6h→再用25％异丙醇溶液以0.2ml／min流速冲洗约1h→然后用纯水以0.5ml／min流速冲洗约2h→再用流动相平衡约2h（若流动相中含有缓冲盐，需先用水－有机相，按流动相同比例同流速冲洗约30min），进样检测即可。［备注：手性柱价格昂贵，而再生结果多具有较大不确定性，要么成功要么报废，因此，请谨慎进行手性柱的再生！
３）备注
部分品牌手性柱（eg.YMCCHIRAL VEN手性柱）用纯乙腈保存，通常在反相条件下使用。当出现柱压增高、分离度降低与峰形变差时，需要进行必要的处理。）若为柱头污染，清洗程序如下：反接色谱柱，不接检测器，用流动相冲洗约20倍柱体积→用纯水冲洗约20倍柱体积→正接色谱柱，接或不接检测器，用纯水冲洗约20倍柱体积→接检测器，用流动相平衡至基线平稳，进样测试；若不能解决问题，则需要拆卸筛板清洁（程序同反相柱），必要时更换筛板。
五、亲水性色谱柱
一般同正相色谱柱，可参考氨基柱与氰基柱的处理方法；亦可根据色谱柱的可能污染情况，合理选择溶剂冲洗与再生。
六、氨基酸分析柱
一般同C18柱，可参考C18柱的处方法；亦可根据色谱柱的可能污染情况，合理选择溶剂冲洗与再生。
