质谱沙龙第十九期活动报道
2009年5月23日，质谱沙龙第十九期活动在清华大学生物医学测试中心举行。此次到会者除了来自二炮总医院、西苑医院、清华大学医学院、发酵研究院、中科院微生物研究所、空军总医院、天津博纳艾杰尔科技、AB公司等老朋友外，还有来自戴安公司、东西电子的新朋友。报告后的讨论一直洋溢着热烈的气氛。
第十九期质谱沙龙活动现场
清华大学生物医学测试中心概况及ETD离子源介绍
首先由来自清华大学生物医学测试中心的李春波老师，为大家介绍了《生物医学测试中心概况及ETD离子源介绍》。
清华大学生物医学测试中心 李春波老师
清华大学生物医学测试中心下设实验动物平台、细胞生物学平台、蛋白质化学平台和同位素实验室四个部分，主要为校内生物、医学及相关学科的科研和教学工作提供技术支撑与服务，同时面向社会开放。
实验动物平台总面积超过2000cm2，被改造成为SPF级动物房。实验设备配有病理切片系统和显微操作系统。
细胞生物学平台具备先进的活细胞共聚焦显微镜系统、美国BD公司生产的FACSAria Ⅱ流式细胞分选仪、德国蔡司LSM710激光共聚焦显微镜系统、以及日本OLYMPUS公司的双光子显微镜，对生物样品深度成像可达400微米。
蛋白质化学平台主要仪器设备包括美国ABI公司4800plus TOF/TOF质谱仪，Agilent 6300液相色谱质谱联用仪，前端配有二维液相色谱系统，包括一个nano泵和一个capillary泵，并配有AgilentZL技术的Chip源，把二维的分析柱和Nanospray喷针整合到了芯片上，在喷雾的重现性和灵敏度上都比常规的nanospray源有提高。质谱上配备了ESI和ETD源，李老师实验室配备的是安捷伦第二代的ETD源，是国内的第一台安捷伦配备ETD源的质谱。还配备了Agilent1200常规液相色谱系统，主要为生物医学方面提供简单的纯度分析和浓缩制备。
同位素实验室主要配有液体闪烁计数仪、伽马射线计数仪。
接下来，李春波老师简单地介绍了ETD离子源。ETD(Electron Transfer Dissociation)即为电子转移解离裂解源。
ETD作为一种新型的肽段序列测定技术,与FT质谱中的电子捕获解离技术(ECD)具有类似的裂解过程。生物中常见的多肽蛋白质带有多价电荷，通过对其转移一个低能热电子形成带基电荷的离子后，该片段十分不稳定、会发生断裂。
ETD本质就是一个负化学源，过程中需要甲烷气体，首先在70eV的能量下激发后，甲烷气体被电离，产生两个低能的热电子，热电子被该离子源捕获以后，形成一种阴蒽离子，该离子与高价多肽离子进行反应，把电子转移到多肽离子上，这时多肽离子就会带有一个基电子，带了基电子后的多肽离子十分不稳定随即在离子阱里发生断裂。
一般CID源多产生b、y离子，而ETD源多产生c、z离子，结合CID的碎片后，对蛋白质的多肽序列覆盖率会更高，这样对于蛋白质的鉴定更好。同时，ETD比CID源也相对更温和，在蛋白质的修饰测定方面，对修饰的基团进行保护，修饰的骨架不断裂，从而更有利于翻译后修饰的测定。
Thermo和Agilent/Bruker的ETD源的差别是：前者在阱的后端，后者在阱的前端。
ETD离子源相对CID灵敏度要低5~10倍，对单价或二价的多肽蛋白质裂解不具有优势，如果蛋白量不多的话，并没有优势。而对于多价(≥3价)的多肽离子有优势。在一个样品中，可以只做CID，也可以只做ETD，也可以切换做，但是切换时对样品量的要求就更多。一般来说，ETD做的一般都要>15个氨基酸，低于15个氨基酸的一般不断裂，即一般对大分子量的多肽断裂。当然，随之带来的是，GluC酶会比胰蛋白酶好，因为切出的肽段大一些。李老师还介绍了近期调节ETD的一些经验，比如，需要调节阴蒽离子(m/z 202)的信号强度至少达到10e6左右，而其同位素峰203不能太高，这样才能获得较好的ETD断裂效果。
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生物质谱在微生物研究中的应用
来自中科院微生物研究所罗元明老师跟大家一起探讨了《生物质谱在微生物研究中的应用》的报告。
中科院微生物研究所 罗元明老师
罗老师首先简单介绍了中科院微生物研究所质谱技术平台，该平台包括ProteomeX二维液相色谱离子阱质谱联用仪、4700 MALDI-TOF-TOF、GC-MS同位素比质谱仪，以及多台HPLC和离子色谱等;并将要在近两年内引进Triple Q三重四极杆质谱仪、高分辨串联液质联用如Q-TOF(或LTQ-Qritrap)等质谱。
罗元明老师根据自己多年的工作经验，向大家介绍了质谱技术在微生物领域的研究内容，内容丰富翔实。
1、环境、能源及医药微生物学领域特定小分子结构鉴定
应用离子阱质谱技术，主要用来进行定性分析，鉴定是否含有某种已知小分子;检测反应体系中的底物、中间产物及终产物，鉴定其结构，并建立了部分结构数据库。
2、寡核苷酸的鉴定及定量
在微生物领域里有一些菌产生的蛋白，由于催化作用可以合成或降解为寡核苷酸，所以需要进行对该物质的鉴定及定量。
由十个碱基以上组成的多个核苷酸，样品前处理中脱盐步骤比较容易，罗老师在这里提出一个难题就是对于一些单核苷酸、二核苷酸就比较困难，一般的C18柱无法吸附，导致无法进行脱盐。在座的戴安公司工程师提供了一些可能的解决方案， 比如离子交换柱。体积为几个微升，绝对量对大概纳克级。
3、寡糖鉴定-LC-MS/MS鉴定
在微生物领域里，一些真菌常见的致病菌的细胞壁是糖蛋白，一般研究糖蛋白的方法就是把蛋白质链上的寡糖切下来利用质谱技术进行鉴定。
4、蛋白质鉴定
蛋白质鉴定相对来说比较容易，该技术来罗老师实验室送样的也较多，不再详细说明。
5、表达蛋白质组学研究
在微生物领域里，有些物种是中国所特有的，还有些物种是在特殊条件下形成的，所以研究其表达蛋白质组学是非常有意义的。除了研究细菌或细胞全蛋白质组外，还对细胞壁蛋白质组、细胞膜蛋白质组以及各亚细胞结构蛋白质组，及它们的比较蛋白质组和定量蛋白质组等进行研究。
目前比较蛋白质组学共有3条研究路线分别是：
- 比较经典的二维电泳(2DE)方法
- 基于稳定同位素标记的蛋白质组学分析方法
- 多维液相色谱质谱联用技术
但第3条蛋白质组不能太大，因为太大的重现性不好，但对于蛋白质少的体系如细胞器蛋白质组，是可以应用该方法的。其中稳定同位素标记的定量蛋白质组学研究有3种方法。一是代谢标记，在体内细胞或细菌中利用没有毒性的稳定同位素(13C, 15N)进行标定；二是可用的商业化试剂，例如ICAT和iTRAQ试剂；三是酶促同位素标记，一般应用的是18O进行标记，在酶切的时候加入H218O。
亚细胞蛋白质组研究中主要对膜蛋白质组、细胞壁蛋白质组、纤维小体蛋白组以及翻译后修饰蛋白组进行研究。其中，真菌中的纤维小体常具有降解纤维素的活性，在生物能源中用得很多，其蛋白质组不是非常复杂值得研究。另外在翻译后修饰的研究中，罗博士举例了其小组研究烟曲霉(一种真菌)细胞膜的蛋白质组，找到了其糖基化的一些途径，经过细胞学验证后非常有意义，并进一步做了糖基化位点和结构的鉴定。
6、功能蛋白质组学研究
功能蛋白质组学的主要研究方向是蛋白相互作用、亚细胞定位以及翻译后修饰等。
首先介绍了蛋白相互作用复合物的研究，并对仪器的分子量和分辨率提出了新要求：比如分子量为几十万的蛋白复合物，其分子伴侣很小，如用MALDI-TOF测定，反射时分子量范围不够，用线性模式分辨率不够无法观察分子伴侣;所以必须要上高分辨率(如Q-TOF或Orbitrap)的液质联用，才能看到分子伴侣。
在蛋白质翻译后修饰研究中糖基化、磷酸化、泛素化研究相对来说是比较难的，其它的相对简单，不需要特异的富集;接下来主要介绍了这几种情况的分析方法。
蛋白质糖基化
在真核中总结的规律是：最常见的是在天冬酰氨的N-糖基化和发生在丝氨酸的O-糖基化。糖基化物质相对来说比较少，所以在质谱上显示峰度很低，所以一般需要富集;或采用荧光染料或化学试剂进行染色处理。
罗老师在这里例举了利用苯肼标记膜蛋白中的糖蛋白使其稳定，收集后会产生长短不同的寡糖多肽，选用最长的两段(m/z 1021.30和1224.55)利用液质联用技术进行糖蛋白中N-连接寡糖位点和结构的鉴定。
蛋白质磷酸化
蛋白磷酸化也是有规律的，位点一般发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸这类氨基酸上。分析步骤一般首先鉴定蛋白质，鉴定后通过数据库寻找到它的磷酸化一级碎片，通过优化能量，得到信息比较详细的二级碎片，把带有磷酸基团的碎片标记上，就说明鉴定是成功的。由于磷酸化信号很弱，一般利用磷酸化抗体进行富集处理;也可利用结合亲和色谱螯合离子/金属离子的方法(如Fe3+、Ga3+)。Millipore公司也提供Tip头吸附来富集;也有人用荧光染色的方法来找到磷酸化的蛋白质。
蛋白质甲基化
蛋白质甲基化一般发生在赖氨酸上，产生单甲基化、双甲基化和三甲基化，少数情况也发生在谷氨酸上。罗老师介绍了其发表在核酸研究(Nucl Acids Res)上的工作：研究了一种嗜热菌，首先采用MALDI-TOF质谱技术，观察到峰之间都相差14Da，推测可能是甲基化反应，然后酶切后作一级质谱找甲基化片段，在TOF/TOF二级质谱上找到赖氨酸标记的甲基化14的片段。罗老师也提到，甲基化/乙基化相对糖基化/磷酸化好做一些;另外该实验测定的只有6000 Da的蛋白，MALDI-TOF尚可，以后做到更大的，只能用高分辨的液质联用。
7、末端蛋白质组学
末端蛋白质组学是比较前沿的技术，罗老师在这里提出了以下几个问题：
- 为什么同一蛋白在1DE和2DE中出现在不同的位置?有些可能是人为操作引起的，有些是不同功能的蛋白存在不同的修饰本身就会分开，如何鉴定?
- 如果物种的基因组未测序，怎样才能知道蛋白序列?因为不可能把每一种物种的全基因组都测序，蛋白质又存在各种剪接、加工、修饰，并和功能相关。
- 怎样判断所表达的蛋白在不同位点终止以及不同修饰(C-末端鉴定)?
- 怎样判断N-末端的信号肽、是否是甲硫氨酸Met起始及其他修饰?
- 代谢组学领域活性多肽或修饰片段的鉴定。
所有以上问题是蛋白质功能研究所必须解决而不可避免的问题，也是目前功能基因组研究的热点和难点，所有这些问题的解决都可能从末端测序找到答案，虽然大量文献报道C末端或N末端标记，但目前没有成熟稳定的技术。标记技术如稳定，从末端的测序和解谱是相对容易和可能的，另外，标记后要能够纯化出来。
在谈完对末端标记/测序技术的畅想外，罗老师还提出了两个难点，希望大家多探讨：
(1) 在定量蛋白质组学里，寻找微量物质和准确定量的问题，目前多用标记，但标记重复性和标记效率都有待提高。
(2) 对一些分子量比较大的蛋白复合物的研究，除了对仪器性能要求较高以外还存在一些比较复杂的难点。
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中药人参皂苷类成分质谱测定的方法研究
最后由来自西苑医院的林力老师为大家带来了《中药人参皂苷类成分质谱测定的方法研究》报告。
西苑医院 林力老师
人参主要包括皂苷类、多糖类和氨基酸类这三种成分。林力老师主要研究的是利用质谱技术测定人参皂苷类的成分。
初期实验方法的问题
在初期建立分析方法中，经过检测后存在以下几个问题：
1、不多
只选择了Rg1、Re、Rb1、Rd这4个成分进行检测，而皂苷类物质成分很多;
2、不快
在质谱分析中的保留时间为15min，应优化保留时间;
3、不好
检测灵敏度不高，在高剂量给药时Rg1、Re能检测到，而在中剂量和低剂量给药时，Rg1、Re检测点就十分少，所以需要优化色谱和质谱条件，来提高检测灵敏度。
4、不省
溶剂流速0.5ml/min，相对消耗较多。
实验方法的改善
根据以上问题，林老师接下来从以下几个方面进行了分析方法的优化和解决。
入血成分解析
人参皂苷类成分在体外能检测到几十种，而在体内由于生物屏障的影响入血成分很少。首先采用AB公司的4000 Qtrap进行定性分析，对大鼠给药后的入血成分进行结构解析。采用在前期预实验中比较好的吸收点，对该点进行富集之后采用Q3 MS-IDA-EPI-EPI(即二级全扫描)的方法进行检测。
在血液中可以检测到的化学成分包括原人参二醇型的Rb1、Rd、Rc、Rb2/3;原人参三醇型的Rg1、Re、Rf、Rg2和齐墩果酸型中的Ro。其中Rg2、Ro检测点很少，所以主要检测其它几种化学成分。
仔细分析这些成分的化学结构可以得到更多的信息。Rd和Re的分子式和分子量是完全一样的，唯一的区别就是分别为二醇型和三醇型。从质谱图上可以很容易地区分这两个成分。
而属二醇型的Rc、Rb2和Rb3分子式和分子量完全一致，属于同分异构体。在质谱图中可以发现Rb2和Rb3由于分析结构式十分接近所以很难分离，而Rc与Rb2和Rb3之间也比较接近，所以需要优化其色谱参数，经过反复的分离之后才能达到理想的效果。
调整固定相
由原先采用的SB-C18(150×4.6 mm ，5mm)柱子，改为Symmetry C18(150×2.1 mm ，5mm)柱子。这里面还有一个插曲，原来用2.1mm色谱柱不理想，因为液相系统死体积过大，后来用4.6mm，在溶剂耗费、灵敏度、稳定性等方面还是不理想，改回2.1 mm前，把液相的管路全换成了低死体积的，才最终解决了该问题。
调整流动相
经过大量实验得出，乙酸铵系统灵敏度高，但是受血浆干扰大稳定性不佳，甲酸系统灵敏度低但是抗干扰能力强。甲酸的浓度、起始水相的比例以及梯度对检测灵敏度都有一定的影响。最后选用的是甲酸体系。
四元泵问题
林老师在这里提到一个问题就是确定检测方法之后，在隔天进行检测时发现保留时间有所变化。经过反复实验得出原因应该是由于流速偏低，使得泵的精度有些差异，解决方案是对单个泵先采用高流速冲洗之后，选择初始有机相比例再用高流速进行冲洗，再去平衡色谱柱，之后保留时间就会恢复到原先的检测结果。因此林老师强调指出不要忽视液相系统在质谱定量中的作用。
达到预期目标
最终采用水相：0.01%甲酸水，有机相：甲醇/乙腈混合液(含0.01%甲酸);230uL的流速，柱温25℃的检测条件，基本解决了初期检测中的问题。
1、多
检测成分由开始的4个增加到7个(Rb1、Rd、Rc、Rb2/3、Rg1、Re、Rf)。
2、不快
保留时间为15min优化到14.5min，对于该液相系统基本上已经达到最佳优化时间。
3、好
检测灵敏度由1 ng/mL提高到0.06ng/mL。
4、省
溶剂流速由0.5ml/min降低到0.23ml/min。
最后林老师根据自己在实验中的心得体会，在多成分定量分析研究中总结了几点应当注意的环节。
一是内标的选择，在多组分定量中选择一个恰当合适的内标是十分困难的，最后这个实验还是用的外标法，因为内标很难保证所有组分都满足药动要求;二是样品前处理中选择前处理方法要同时兼顾到多成分的化学性质，该实验最终选用的是液液萃取，因为固相萃取对某些组分存在严重吸附洗脱不下来;最后一点就是在进行多成分同时检测时不要单单按照正离子或负离子进行分类，还要考虑到按化学性质进行分类。
获得这些结果，林老师花费了一个月的时间主要来优化色谱条件，他最后的总结对每个液质联用工作者都很有借鉴意义：完成一个实验，质谱上花的精力大概是10%，而色谱上要花费90%的精力。
本网收录前沿Lab： 中国中医科学院西苑医院 药代动力学实验室
报告下载：《中药人参皂苷类成分质谱测定的方法研究》
